Ključne riječi

slobodni radikal/antioksidans/ antioksidativno djelovanje / ukupni antioksidativni kapacitet / hemiluminiscencija/ luminol / slobodni radikal / antioksidans / antioksidativna aktivnost / ukupni antioksidativni kapacitet / hemiluminiscencija / luminol

anotacija naučni članak o hemijskim naukama, autor naučnog članka - Georgij Konstantinovič Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu. A. Vladimirov

Ljekoviti biljni materijali su jedan od izvora antioksidansa za ljudski organizam. Među metodama za određivanje sadržaja antioksidansa u biljnim objektima rasprostranjena je metoda hemiluminiscentne analize. U ovom radu je korišten za procjenu ukupni antioksidativni kapacitet(OAU) dekocije plodova vrane, divlje ruže i gloga i infuzija plodova maline. U eksperimentu je zabilježena kinetika hemiluminiscencija u sistemu koji se sastoji od peroksidaze hrena, vodonik peroksida i luminola. Koncentracije i zapremine komponenti sistema u uzorku odabrane su tako da su jaki antioksidansi (askorbinska kiselina) i umereno jaki antioksidansi (kvercetin) potpuno oksidovani tokom merenja (10 min). Predložena je i opravdana metoda za izračunavanje TAU-a na osnovu promjene svjetlosne sume. hemiluminiscencija u prisustvu biljnih uzoraka. Kinetička analiza hemiluminiscencija pokazalo da u proučavanim objektima prevladavaju antioksidansi srednje jačine, uključujući flavonoide, i slabi antioksidansi (tokoferol i dr.). Poređenje izračunatih RAU vrijednosti za proučavane objekte i njihove podatke hemijska analiza pokazalo da se hrana koja sadrži istu količinu antioksidansa s različitim omjerima po vrstama može razlikovati po svojoj sposobnosti da zaštiti tijelo od štetnih efekata slobodni radikali. Opisana tehnika je obećavajuća za proučavanje biljnih objekata koji sadrže mješavinu antioksidansa različitih vrsta.

Povezane teme naučni radovi iz hemijskih nauka, autor naučnog rada - Georgij Konstantinovič Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu. A. Vladimirov

2016 / Georgiy Vladimirov, Sergunova E.V., Izmaylov D.Yu., Vladimirov Yu.A.
Određivanje antioksidansa aktiviranom hemiluminiscencijom pomoću 2,2"-azo-bis(2-amidinopropana)
2012 / Aleksejev A.V., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A.
Antioksidativno djelovanje dihidrokvercetina i rutina u reakcijama peroksidaze koje katalizira citokrom c
2008 / Demin E.M., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A.
Procjena oksidativnog i antioksidativnog kapaciteta bioloških supstrata kemiluminiscencijom izazvanom Fentonovom reakcijom
2016 / Piskarev Igor Mihajlovič, I.P. Ivanova
Određivanje sadržaja lipohidroperoksida u lipoproteinima krvnog seruma pomoću mikroperoksidaza-luminol sistema
2011 / Teselkin Jurij Olegovič, Babenkova Irina Vladimirovna
Metode za proučavanje antioksidansa
2004 / Khasanov V. V., Ryzhova G. L., Maltseva E. V.
Antioksidativno djelovanje biljaka koje se koriste u etnomedicini Tuve
2012 / Chekhani N.R., Teselkin Yu.O., Pavlova L.A., Kozin S.V., Lyubitsky O.B.
Proučavanje antioksidativnih svojstava Fosprenila u različitim biološkim test sistemima
2017 / A. V. Sanin, A. N. Narovlyansky, A. V. Pronin, T. N. Kozhevnikova, V. Yu. Sanina, A. D. Agafonova
Utjecaj različitih doza polikloriranih bifenila na stanje spontane i imunoglobulinom izazvane hemiluminiscencije pune krvi zavisne od luminola
2016 / Gabdulkhakova I.R., Kayumova A.F., Samohodova O.V.
Evaluacija sistema antioksidativne zaštite lipidne peroksidacije kod djece sa esencijalnom arterijskom hipertenzijom spektrofotometrijskim i hemiluminiscentnim metodama
2014 / Natyaganova Larisa Viktorovna, Gavrilova Oksana Aleksandrovna, Kolesnikova Larisa Romanovna

Hemiluminiscentno određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta u ljekovitom biljnom materijalu

Ljekoviti biljni materijal jedan je od izvora antioksidansa za ljudski organizam. Hemiluminiscencijska analiza je jedna od uobičajenih metoda za određivanje sadržaja antioksidansa u biljnim materijalima. U našem radu hemiluminiscentnom analizom je određivan ukupni antioksidativni kapacitet (TAC) voćnih dekocija planinskog pepela, ruže i gloga, kao i infuzije plodova maline. Eksperimentima je utvrđena kinetika hemiluminiscencije sistema koji se sastoji od peroksidaze hrena, vodonik peroksida i luminola. Koncentracije i zapremine komponenti sistema odabrane su tako da su jaki antioksidansi (askorbinska kiselina) i antioksidansi prosečne snage (kvercetin) potpuno oksidovani tokom merenja (10 minuta). Predložena je i utemeljena metoda za proračun TAC-a zasnovana na promjenama hemiluminiscencije svjetlosne sume u prisustvu biljnih uzoraka. Analiza kinetike hemiluminiscencije pokazala je da u proučavanim objektima dominiraju antioksidansi prosječne snage, uključujući flavonoide i slabe antioksidante (tokoferol i drugi). Poređenje izračunatih TAC vrijednosti za objekte koji se proučavaju i podataka njihove kemijske analize pokazalo je da proizvodi koji sadrže istu količinu antioksidansa s različitim omjerima antioksidanata po vrstama mogu varirati u svojoj sposobnosti da zaštite tijelo od štetnog djelovanja slobodnih radikala. . Opisana tehnika je obećavajuća za proučavanje biljnih objekata koji sadrže mješavinu različitih vrsta antioksidansa.

Tekst naučnog rada na temu "Kemiluminiscentna metoda za određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta u ljekovitom biljnom materijalu"

hemiluminiscentna metoda za određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta u ljekovitom biljnom materijalu

G. K. Vladimirov1^, E. V. Sergunova2, D. Yu. Izmailov1, Yu. A. Vladimirov1

1 Katedra za medicinsku biofiziku, fakultet fundamentalna medicina, Moskva Državni univerzitet nazvan po M.V. Lomonosovu, Moskva

2 Katedra za farmakognoziju, Farmaceutski fakultet,

I. M. Sechenov Prvi moskovski državni medicinski univerzitet, Moskva

Ljekoviti biljni materijali su jedan od izvora antioksidansa za ljudski organizam. Među metodama za određivanje sadržaja antioksidansa u biljnim objektima rasprostranjena je metoda hemiluminiscentne analize. U ovom radu korišćen je za procenu ukupnog antioksidativnog kapaciteta (TOA) dekocija plodova vrane, divlje ruže i gloga i infuzije plodova maline. U eksperimentu je zabilježena kinetika hemiluminiscencije u sistemu koji se sastoji od peroksidaze hrena, vodonik peroksida i luminola. Koncentracije i zapremine komponenti sistema u uzorku odabrane su tako da su jaki antioksidansi (askorbinska kiselina) i umereno jaki antioksidansi (kvercetin) potpuno oksidovani tokom merenja (10 min). Predložena je i obrazložena metoda za izračunavanje RAE na osnovu promjene kemiluminiscencije svjetlosne sume u prisustvu biljnih uzoraka. Analiza kinetike hemiluminiscencije pokazala je da u ispitivanim objektima prevladavaju umjereno jaki antioksidansi, uključujući flavonoide, i slabi antioksidansi (tokoferol i dr.). Poređenje izračunatih TAU vrijednosti za proučavane objekte i podataka njihove kemijske analize pokazalo je da se proizvodi koji sadrže istu količinu antioksidansa s različitim omjerima po vrstama mogu razlikovati po svojoj sposobnosti zaštite organizma od štetnog djelovanja slobodnih radikala. Opisana tehnika je obećavajuća za proučavanje biljnih objekata koji sadrže mješavinu antioksidansa različitih vrsta.

Ključne riječi: slobodni radikal, antioksidans, antioksidativna aktivnost, ukupni antioksidativni kapacitet, hemiluminiscencija, luminol

Finansiranje: Ovaj rad je podržan od strane Ruske naučne fondacije, grant broj 14-15-00375.

Ex3 Prepisku treba adresirati: Georgij Konstantinovič Vladimirov

119192, Moskva, Lomonosovski pr-t, 31, zgrada 5; [email protected]

Članak primljen: 10.03.2016. Članak prihvaćen za objavljivanje: 18.03.2016.

hemiluminiscentno određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta u ljekovitom biljnom materijalu

1 Katedra za medicinsku biofiziku, Fakultet fundamentalne medicine, Moskovski državni univerzitet Lomonosov, Moskva, Rusija

2 Katedra za farmakognoziju, Farmaceutski fakultet,

Prvi Moskovski državni medicinski univerzitet Sečenov, Moskva, Rusija

Ključne riječi: slobodni radikal, antioksidans, antioksidativna aktivnost, ukupni antioksidativni kapacitet, hemiluminiscencija, luminol

Finansiranje: ovaj rad je podržan od strane Ruske naučne fondacije, grant br. 14-15-00375.

Priznanja: autori zahvaljuju Andreju Aleksejevu sa Moskovskog državnog univerziteta Lomonosov za njegovu pomoć u sprovođenju eksperimenta. Prepisku treba obratiti: George Vladimirov

Lomonosovskiy prospekt, d. 31, k. 5, Moskva, Rusija, 119192; [email protected] Primljeno: 03.10.2016. Prihvaćeno: 18.03.2016.

Slobodni radikali koji nastaju u tijelu narušavaju strukturu ćelijskih membrana, što zauzvrat dovodi do razvoja različitih patoloških stanja. Destruktivno oksidativno dejstvo radikala sprečava antioksidativni odbrambeni sistem organizma, u kojem važnu ulogu igraju niskomolekularna jedinjenja - presretače (zamke) radikala. Jedan od izvora antioksidansa su ljekovite biljne sirovine, kao i preparati na njihovoj osnovi, čije proučavanje antioksidativnog potencijala pomaže u povećanju njihovog preventivnog i terapijskog djelovanja.

U radovima se razmatraju glavne metode za određivanje antioksidansa, međutim, definicija antioksidansa kao hemijska jedinjenja ne daje potpunu sliku o zaštitnim svojstvima predmeta koji se proučava: ona su određena ne samo količinom jednog ili drugog antioksidansa, već i aktivnošću svakog od njih. Antioksidativna aktivnost, ili antioksidativna aktivnost, AOA, je konstanta brzine za reakciju antioksidansa sa slobodnim radikalom (kInH). Metoda hemiluminiscencije (CL) omogućava određivanje ukupne količine radikala koje antioksidansi vezuju u uzorku (ukupni antioksidativni kapacitet, TAU), a kada se koristi metoda matematičko modeliranje CL kinetika - također brzina stvaranja i reakcije radikala sa antioksidansima, odnosno AOA.

Najčešća modifikacija hemiluminiscentne metode za određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta zasniva se na upotrebi luminola kao aktivatora hemiluminiscencije. U kivetu hemiluminometra se stavlja uzorak uz dodatak luminola, vodikovog peroksida i jedinjenja sposobnog da generiše radikale kao rezultat spontane razgradnje (termolize), na primjer 2,2"-azobis-(2-amidinopropan). ) dihidroklorid (ABAP):

U prisustvu molekularnog kiseonika, alkil radikal R^ formira peroksilni radikal ROO^:

ROO^ + LH2 ^ ROOH + LHv Od LH, stvaranjem međusupstanci (luminol hidroperoksid i luminol endoperoksid), nastaje molekula krajnjeg proizvoda oksidacije luminola, aminoftalne kiseline, u elektronski pobuđenom stanju, koja emituje foton , i kao rezultat toga, uočena je hemiluminiscencija. Intenzitet CL je proporcionalan brzini proizvodnje fotona, koja je zauzvrat proporcionalna stacionarnoj koncentraciji LH u sistemu. U interakciji s radikalima, antioksidansi prekidaju opisani lanac transformacija i sprječavaju stvaranje fotona.

Jedinjenja podložna termolizi nisu jedini mogući izvor radikala u analizi antioksidativnog kapaciteta uzorka hemiluminiscentnom metodom. Alternative su peroksidaza hrena-vodonik peroksid, hemin-vodonik peroksid, citokrom c-kardiolipin-vodikov peroksid itd. Šema reakcija oksidacije luminola peroksidazama razmatrana je u radu Cormier et al. .

CL kinetičke krive za ove sisteme odražavaju dvije faze reakcije: fazu povećanja intenziteta CL i fazu platoa ili postepenog smanjenja luminiscencije, kada

Intenzitet CL je ili konstantan ili se polako smanjuje. U radu su opisana dva pristupa mjerenju ukupnog antioksidativnog kapaciteta koji uzimaju u obzir ovu osobinu krivulja. TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) metoda se temelji na mjerenju CL latencije t i može se koristiti za određivanje antioksidansa kao što su trolox ili askorbinska kiselina: oni se odlikuju velikom konstantom brzine reakcije s radikalima i iz tog razloga se mogu nazivaju jakim antioksidansima. Tokom latentnog perioda, oni potpuna oksidacija. Metoda TAR (totalna antioksidativna reaktivnost) mjeri stepen gašenja hemiluminiscencije q na platou ili na maksimumu hemiluminiscentne krivulje:

gdje je I intenzitet hemiluminiscencije bez antioksidansa, a 11 je intenzitet CL u prisustvu antioksidansa. Ova metoda se koristi ako sistem sadrži pretežno slabe antioksidante sa niskim konstantama brzine interakcije sa radikalima - mnogo nižim u poređenju sa luminol konstantom.

Djelovanje antioksidansa karakteriziraju ne samo indikatori t i c. Kao što se može vidjeti iz radova, djelovanje antioksidanata poput mokraćne kiseline u sistemu hemin-H202-luminol ili tokoferola, rutina i kvercetina u sistemu citokroma c-kardiolipin-H202-luminol karakteriše promjena maksimalne brzine. porasta CL (utx). Kao što pokazuju rezultati matematičkog modeliranja kinetike, vrijednosti konstanti brzine interakcije ovih antioksidansa s radikalima su blizu vrijednosti luminol konstante, pa se takvi antioksidansi mogu nazvati antioksidansima srednje jačine.

Ako je materijal koji se proučava, a posebno biljne sirovine, sadržavao samo jednu vrstu antioksidansa, onda bi se njihov sadržaj mogao okarakterizirati jednim od tri gore navedena indikatora (m, q ili V). Ali biljne sirovine sadrže mješavinu antioksidansa. različite snage. Da bi riješili ovaj problem, neki autori su koristili promjenu svjetlosne sume hemiluminiscencije tokom određenog DE vremena, izračunatog po formuli

DE = DE0 - DE,

gdje su DE0 i DE5 CL svjetlosne sume za dato vrijeme? u kontrolnim i ispitnim uzorcima. Vrijeme treba biti dovoljno za oksidaciju svih antioksidanata u sistemu, odnosno da CL kriva ispitnog uzorka dostigne nivo CL krive kontrolnog uzorka. Ovo poslednje sugeriše da istraživači ne bi trebalo samo da zabeleže svetlosnu sumu luminescencije, već i da snime CL kinetičku krivu dovoljno dugo, što se daleko ne radi uvek.

Budući da svi mjereni pokazatelji ovise o instrumentu i uvjetima mjerenja, antioksidativni učinak supstance u ispitivanom sistemu obično se uspoređuje sa učinkom antioksidansa koji se uzima kao standard, na primjer, Trolox.

Sistem peroksidaza ren-vodonik peroksid koristili su mnogi autori za analizu ukupnog antioksidativnog kapaciteta biljnog materijala. U radovima je za procjenu količine antioksidansa u uzorcima korišten CL latentni period (TRAP metoda), au radu je korištena površina ispod krivulje razvoja CL. Međutim, ovi radovi ne daju jasno opravdanje

izbor jednog ili drugog parametra za procjenu OAU.

Cilj istraživanja bio je utvrditi kakav je omjer antioksidansa razne vrste utiče na TAU, i modifikuju metod hemiluminiscencije na način da se može preciznije odrediti TAU u biljnom materijalu. Da bismo to učinili, postavili smo si nekoliko zadataka. Prvo, uporediti kinetiku CL proučavanih objekata sa kinetikom standardnih antioksidanata tri tipa (jaki, srednji i slabi) kako bi se razumjelo koji tip antioksidansa daje glavni doprinos TAE-u proučavanih objekata. Drugo, izračunati TAE proučavanih objekata mjerenjem smanjenja svjetlosne sume CL pod djelovanjem ovih objekata u poređenju sa djelovanjem antioksidansa, koji daje najveći doprinos TAE.

MATERIJALI I METODE

Predmet istraživanja bili su industrijski uzorci plodova gloga, planinskog pepela i divlje ruže koje proizvodi Krasnogorskleksredstva dd (Rusija), kao i plodovi maline koje su autori sakupili u Moskovskoj oblasti u prirodnim uslovima uzgoja i sušeni na temperaturi od 60°C. 80°C dok ne prestanu da izoluju sok i deformacije pritiska.

Reagensi za analizu antioksidativnog kapaciteta hemiluminiscentnom metodom bili su: KH2PO4, 20 mM puferski rastvor (pH 7,4); peroksidaza iz korijena hrena (aktivnost 112 jedinica/mg, M = 44 173,9), 1 mM vodeni rastvor; luminol (5-amino-1,2,3,4-tetrahidro-1,4-ftalazindion, hidrazid 3-aminoftalne kiseline, M=177,11), 1 mM vodeni rastvor; vodonik peroksid (H2O2, M = 34,01), 1 mM vodeni rastvor; rastvori antioksidansa (askorbinska kiselina, kvercetin, tokoferol). Svi reagensi su proizvedeni od strane Sigma Aldrich (SAD).

Uvarci plodova gloga, planinskog pepela i divlje ruže i infuzija plodova maline pripremljeni su prema metodologiji Državne farmakopeje SSSR-a, navedenoj u općem farmakopejskom članku "Infuzije i dekocije".

Ukupni antioksidativni kapacitet određen je snimanjem hemiluminiscencije na hemiluminometru Lum-100 (DISoft, Rusija) korišćenjem softvera PowerGraph 3.3. Za određivanje TAU-a u biljnom materijalu, 40 µl luminola u koncentraciji od 1 mM, 40 µl peroksidaze iz hrena u koncentraciji od 0,1 µM, od 10 do 50 µl dekokcije ili infuzije (ovisno o koncentraciji) i fosfatni pufer u količini potrebnoj da se ukupna zapremina uzorka dovede do 1 ml. Kiveta je ugrađena u uređaj i CL je snimljen, posmatrajući pozadinski signal. Nakon 48 s registracije pozadinskog signala, u kivetu je dodato 100 μl H2O2 u koncentraciji od 1 mM, a registracija CL je nastavljena 10 min. Pripremljena su četiri uzorka sa različitim koncentracijama svakog od biljnih objekata. CL je također zabilježen za otopine askorbinske kiseline, kvercetina i tokoferola u pet različitih koncentracija za svaki od antioksidansa. Nakon toga, TAU uzoraka dekocija i infuzija je ponovo izračunat za kvercetin.

Koncentracije luminola, peroksidaze hrena i vodikovog peroksida odabrane su tako da se u razumnom vremenu (ne više od 10 min) odredi antioksidativni kapacitet vodenih ekstrakata iz ljekovitog biljnog materijala. Za to vrijeme, krivulje hemiluminiscencije za antioksidanse askorbat i flavonoid kvercetin (glavni antioksidansi biljnog materijala)

dostigla plato, što je ukazivalo na potpuno uništenje antioksidansa u sistemu. Razblaženja proučavanih uzoraka i koncentracije rastvora standardnih antioksidanata (navedene u natpisima slika) odabrane su na način da su sve CL kinetičke krive merene pri istoj osetljivosti instrumenta.

Antioksidativni kapacitet izračunat je iz promjene površine (AS) ispod kinetičke krivulje hemiluminiscencije (svjetlosne sume) nakon dodavanja tvari koja sadrži antioksidans. Da bismo to uradili, izračunali smo S0 za sistem bez antioksidansa i od njega oduzeli površinu SS, koja karakteriše sistem u koji je dodat antioksidans. AS vrijednost zavisi od osjetljivosti hemiluminometra i uslova mjerenja. Odnos AS/C ■ V (gde je C koncentracija proučavanog biološkog materijala u kiveti, g/l, a V zapremina kivete, l) izražava antioksidativni kapacitet 1 g ispitivanog materijala, tj. , biljni materijal.

Na sličan način izračunat je i antioksidativni kapacitet ASa otopine standardnog antioksidansa, na primjer, kvercetina, stavljenog u istu zapreminu reakcione smjese. Odnos AS/CÄ ■ V (gdje je CA težinska koncentracija antioksidansa u kiveti, g/l) izražava antioksidativni kapacitet 1 g antioksidansa.

Za svaki od standardnih antioksidansa zabilježen je signal iz otopina nekoliko koncentracija kako bi se osiguralo da se proračuni izvode u granicama linearnog odnosa i da su dobiveni rezultati ponovljivi. Zaista, dobijena je linearna zavisnost (ASa = kA ■ CA) signala o koncentraciji, iz koje je izračunat stehiometrijski koeficijent kA. Prema Fišerovom kriterijumu, dobijene vrednosti kA za standardne antioksidante su statistički značajne sa verovatnoćom od 0,975. Zatim je zabilježen signal iz četiri koncentracije za svaki od četiri uzorka biljaka i za sve uzorke koje smo dobili linearna zavisnost signal iz koncentracije (AS = k ■ C), iz koje je izračunat stehiometrijski koeficijent k. Sa vjerovatnoćom od 0,975 (Fischerov test), k vrijednosti dobijene za uzorke biljaka su statistički značajne. Ukupni antioksidativni kapacitet biljnog materijala u odnosu na masu standardnog antioksidansa (mg%) utvrđen je formulom

OAU = k ■ 105. k

Vrijednosti su predstavljene kao aritmetička sredina ± standardna devijacija (M ± 5) na p<0,05.

REZULTATI ISTRAŽIVANJA

Proučavanje kinetike hemiluminiscencije u prisustvu natrijum askorbata (slika 1) pokazalo je da ovaj antioksidans karakteriše latentni period, kada je CL skoro potpuno potisnut. Njegovo trajanje je proporcionalno količini antioksidansa u sistemu. U ovom slučaju se ne mijenja ni nagib krivulje CL niti intenzitet CL na platou. To se objašnjava činjenicom da je askorbinska kiselina jak antioksidans koji presreće sve radikale nastale u sistemu, uključujući i luminol radikale, a CL se ne razvija dok se sav askorbat ne oksidira.

Djelovanje tokoferola (slika 2) manifestiralo se smanjenjem intenziteta CL na platou, što je tipično za slabe antioksidante, iako se tokoferol smatra jednim od

moćni antioksidansi. Možda je ovo neslaganje posljedica činjenice da su u našem eksperimentu slobodni radikali bili u vodenoj otopini, dok se djelovanje tokoferola obično proučava u nepolarnim medijima. U radu, gde je kompleks citokroma c sa kardiolipinom služio kao izvor radikala, a reakcija sa luminolom se odvijala unutar ovog kompleksa, tokoferol je imao svojstva antioksidansa srednje jačine.

Proučavajući uticaj različitih koncentracija kvercetina na naš sistem (slika 3) i upoređujući kinetičke krivulje za njega i natrijum askorbat i tokoferol, može se primetiti da se glavni efekat kvercetina manifestuje u promeni nagiba kvercetina. krivulje, odnosno brzinu razvoja CL, što je tipično za umjerene antioksidante.

CL krive za sve proučavane dekokcije (slika 4) liče na krivulje za kvercetin uz blagi pad intenziteta CL na kraju, tj.

Vrijeme, min

Rice. 1. Utjecaj natrijum askorbata na kinetiku hemiluminiscencije

Koncentracije komponenti sistema: luminol - 40 μM, peroksidaza rena - 4 nM, vodonik peroksid - 100 μM. Krive: 1 - kontrolni uzorak; 2 - 0,05 μM; 3 - 0,10 μM; 4 - 0,15 μM; 5 - 0,2 μM; 6 - 0,25 μM natrijum askorbat.

plato. Kao što je prikazano u radu, ovakvo ponašanje je tipično za antioksidante srednje jačine, koji u našem slučaju uključuju polifenole – flavonoide i tanine. Za infuziju plodova maline (Sl. 4, D) primetno je smanjenje hemiluminiscencije na nivou platoa, što je tipično za slabe antioksidante, a to je u ovom slučaju tokoferol. Što se tiče kvercetina i tokoferola, infuzija plodova maline sadrži 4,7 ± 0,9 µmol/g kvercetina i 11,9 ± 0,8 µmol/g tokoferola.

Upoređivanjem krivulja hemiluminiscencije dobivenih za različite koncentracije četiri proučavana vodena ekstrakta iz biljnog materijala, pokazalo se da se doprinos srednjih i slabih antioksidansa ukupnom antioksidativnom kapacitetu uzoraka smanjuje sljedećim redoslijedom: infuzija ploda maline (sl. 4, D), odvar plodova šipka (sl. 4, C), odvar od plodova aromana (sl. 4, A), odvar od plodova gloga (sl. 4, B). Vrijednosti AS u smislu koncentracije C ispitivane tvari u kiveti i vrijednosti ukupnog antioksidativnog kapaciteta u smislu kvercetina prikazane su u tabeli.

DISKUSIJA O REZULTATIMA

Podaci dobiveni tijekom eksperimenata i TAU vrijednosti proučavanih objekata izračunate na njihovoj osnovi upoređeni su sa sadržajem glavnih antioksidansa u njima, utvrđenim hemijskim metodama analize. Unatoč činjenici da je pozitivna korelacija između ukupne količine antioksidansa i TAU-a u različitim objektima neosporna, uočljive su razlike između ovih pokazatelja. Na primjer, ako uzmemo zbir sadržaja flavonoida, tanina i askorbinske kiseline, onda se ispostavi da je više od izračunatog TAU-a za sve proučavane objekte, osim za izvarak plodova gloga (tabela).

Drugi istraživači su također pokazali da se rezultati kemijske analize i TAU vrijednost određene hemiluminiscentnom metodom često ne poklapaju. U radu je utvrđen ukupni antioksidativni kapacitet

46 Vrijeme, min

Ja" "h chi----.

Rice. 2. Utjecaj tokoferola na kinetiku hemiluminiscencije

Koncentracije komponenti sistema: luminol - 40 μM, peroksidaza rena - 4 nM, vodonik peroksid - 100 μM. Krive: 1 - kontrolni uzorak; 2 - 0,01 μM; 3 - 0,025 μM; 4 - 0,06 μM; 5 - 0,1 μM; 6 - 0,2 μM tokoferola.

46 Vrijeme, min

Rice. Slika 3. Uticaj kvercetina na kinetiku hemiluminiscencije Koncentracije komponenti sistema: luminol - 40 μM, peroksidaza rena - 4 nM, vodonik peroksid - 100 μM. Krive: 1 - kontrolni uzorak; 2 - 0,02 μM; 3 - 0,03 μM; 4 - 0,04 μM; 5 - 0,05 μM; 6 - 0,06 μM kvercetin.

Vrijeme, min

46 Vrijeme, min

120 I 100 80 \ 60 40 20

46 Vrijeme, min

Rice. Slika 4. Utjecaj dekocija plodova aromana (A), gloga (B), divlje ruže (C) i infuzije plodova maline (D) na kinetiku hemiluminiscencije . (A) Krive: 1 - kontrolni uzorak; 2 - 0,002 g/l; 3 - 0,004 g/l; 4 - 0,006 g/l; 5 - 0,008 g/l odvar od plodova orena. (B) Krive: 1 - kontrolni uzorak; 2 - 0,005 g/l; 3 - 0,0075 g/l; 4 - 0,01 g/l; 5 - 0,0125 g/l odvar od plodova gloga. (C) Krive: 1 - kontrolni uzorak; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,0015 g/l; 4 - 0,002 g/l; 5 - 0,0025 g/l odvar od šipka. (D) Krive: 1 - kontrolni uzorak; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,003 g/l; 4 - 0,004 g/l; 5 - 0,005 g/l infuzije maline.

u sistemu peroksidaza-luminol-vodonik peroksid u korelaciji sa sadržajem jedinjenja triterpena. Međutim, u radu istih autora, u kojem je druga biljka bila predmet proučavanja, nije uočena korelacija između TAU i sadržaja bilo koje grupe supstanci, uključujući flavonoide.

Ova odstupanja su povezana sa najmanje tri faktora. Prvo, važna je aktivnost antioksidansa, odnosno brzina njihove interakcije s radikalima, koja je različita za različite antioksidanse koji čine biljni uzorak. Prema Izmailovu, konstante brzine odgovarajućih reakcija za meksidol, tokoferol i kvercetin odnose se na 0,04:2:60. Drugo, svaki molekul antioksidansa, ulazeći u hemijsku reakciju, može presresti različit broj radikala. Prema radu, kvercetin, mokraćna i askorbinska kiselina su presrele 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 i 0,5 ± 0,2 radikala po reagovanom molekulu antioksidansa, respektivno (korišćen je sistem gemin-H202-luminol). Treće, na rezultate istraživanja moglo bi uticati prisustvo aktivnosti peroksidaze u samim biljnim uzorcima, kao iu radu, kao i prisustvo kalcijuma u uzorcima, koji, kako je prikazano u radu, može povećati aktivnost peroksidaze hrena pod određenim uslovima. Ovo obično rezultira više

veći intenzitet CL na platou nego na kontrolnim krivuljama, što, međutim, nismo uočili.

Prvi faktor oštro ograničava upotrebu takvog parametra kao što je promjena svjetlosne sume, budući da bi vrijeme mjerenja hemiluminiscencije trebalo biti duže od vremena potrošnje svih antioksidansa u test uzorku. Približavanje ovog trenutka može se procijeniti samo mjerenjem kinetike hemiluminiscencije. Osim toga, doprinos slabih antioksidanata OAE je oštro potcijenjen, jer je vrijeme njihove potpune oksidacije višestruko duže od prihvatljivog vremena mjerenja (10-20 min).

Još veći značaj ima stehiometrijski koeficijent antioksidansa. Broj radikala n koje su oni presjekli jednak je

gdje je p stehiometrijski koeficijent, a Am promjena koncentracije antioksidansa tokom mjerenja, u našem slučaju početne koncentracije ispitivane supstance u uzorku za ispitivanje.

Razlika u svjetlosnoj sumi luminiscencije u odsustvu antioksidansa iu njegovom prisustvu je proporcionalna n. Ukupan broj presretnutih radikala je n = Y.p. m,

gdje je stehiometrijski koeficijent određenog antioksidansa, a m njegova koncentracija tijekom promjene

Predmet istraživanja Flavonoidi, mg%* Tanini, mg%* Askorbinska kiselina, mg%* AS/C ■ 10-8, arb. jedinice OAU, mg% kvercetina

Uvarak od plodova orena 8,87 ± 0,01 210,00 ± 10,00 0,67 ± 0,02 7,13 ± 0,96 56,53 ± 7,61

Uvarak od šipka 4,66 ± 0,04 850,00 ± 20,00 3,70 ± 0,12 16,60 ± 3,40 131,63 ± 27,26

Uvarak od plodova gloga 3,01 ± 0,06 12,00 ± 3,00 0,23 ± 0,002 3,18 ± 0,29 25,20 ± 2,32

Infuzija suhih malina 90,00 ± 4,00 40,00 ± 20,00 3,91 ± 0,08 6,65 ± 1,21 52,69 ± 9,56

Napomena: * - podaci iz literature, . AS - promjena svjetlosne sume za uzorak, rel. jedinica, C - koncentracija uzorka u kiveti, g/l. Izračunate vrijednosti su pouzdane na str<0,05. Число измерений для каждого образца - четыре.

renijum. Ukupan broj presretnutih radikala očigledno nije jednak ukupnoj količini antioksidansa, budući da koeficijenti pt ne samo da nisu jednaki jedinici, već se i značajno razlikuju za različite antioksidanse.

Vrijednost n je proporcionalna razlici svjetlosnih suma izmjerenih tokom određenog vremena između uzorka koji sadrži antioksidans i kontrolnog uzorka koji ne sadrži antioksidanse:

gdje je k koeficijent koji je konstantan pod istim uslovima mjerenja.

Metoda razmatrana u članku omogućava određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta, dok hemijska analiza omogućava određivanje ukupnog sadržaja antioksidansa u proizvodu. Stoga se čini da je metoda hemiluminiscencije informativnija od kemijskih analiza.

Uslove koje smo odabrali za procjenu ukupnog antioksidativnog kapaciteta biljnih sirovina snimanjem kinetike hemiluminiscencije u sistemu koji se sastoji od peroksidaze hrena, vodonik peroksida i luminola (koncentracije komponenti su 4 nM, 100 μM, odnosno 40 μM; 20 mM fosfatni pufer, pH 7,4),

osigurava oksidaciju jakih antioksidansa (askorbinska kiselina) i umjerenih antioksidanata (kvercetin) za 10 min. Ovo trajanje mjerenja je pogodno i osigurava potreban kvalitet mjerenja.

Analiza kinetike kemiluminiscencije pokazala je da su u ispitivanim objektima (dekoti od vrane, divlje ruže, plodova gloga i plodova maline) glavni antioksidansi antioksidansi srednje jačine, uključujući flavonoide, i antioksidansi slabe snage (tokoferol i dr. ). Na osnovu smanjenja hemiluminiscencije svjetlosne sume izračunat je ukupni antioksidativni kapacitet za proučavane objekte. Poređenje dobijenih TAU vrednosti sa rezultatima hemijske analize pokazalo je da se proizvodi koji sadrže istu količinu antioksidansa u različitim omjerima mogu razlikovati po svojoj sposobnosti da efikasno zaštite organizam od štetnog dejstva slobodnih radikala. Opisana tehnika je obećavajuća za proučavanje biljnih objekata koji sadrže mješavinu različitih antioksidansa. Istovremeno ga karakterizira jednostavnost i niska cijena istraživanja. Kombinovanje merenja kinetike hemiluminiscencije sa matematičkim modeliranjem reakcija omogućiće ne samo automatizaciju procesa određivanja TAU-a, već i određivanje doprinosa pojedinih grupa antioksidanata indikatoru.

Književnost

1. Proskurnina E. V., Vladimirov Yu. A. Slobodni radikali kao učesnici u regulatornim i patološkim procesima. U: Grigoriev A. I., Vladimirov Yu. A., urednici. Fundamentalne nauke - medicina. Biophys. med. technol. Moskva: MAKS Press; 2015. tom 1. str. 38-71.

3. Khasanov V. V., Ryzhova G. L., Maltseva E. V. Metode za proučavanje antioksidansa. Chem. rast. sirovine. 2004; (3): 63-75.

4. Vasiliev R. F., Kancheva V. D., Fedorova G. F., Batovska D. I., Trofimov A. V. Antioksidativna aktivnost halkona. Hemiluminiscentno određivanje reaktivnosti i kvantno-hemijski proračun energije i strukture reagenasa i intermedijara. Kinetika i kataliza. 2010; 51(4): 533-41.

6. Fedorova GF, Trofimov AV, Vasil "ev RF, Veprintsev TL. Peroksi-

radikalno posredovana hemiluminiscencija: mehanička raznolikost i osnove za antioksidativni test. Arkivoc. 2007; 8:163-215.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Procjena antiradikalnog kapaciteta hemiluminiscencijom luminola izazvanom H2O2-heminom. J Agric Food Chem. 2003. 3. decembra; 51 (25): 7481-8.

9. Vladimirov Yu. A., Proskurnina E. V. Slobodni radikali i ćelijska hemiluminiscencija. Uspjesi biol. chem. 2009; 49:341-88.

10. Vladimirov Yu. A., Proskurnina E. V., Izmailov D. Yu. Kinetička hemiluminiscencija kao metoda za proučavanje reakcija slobodnih radikala. Biofizika. 2011; 56(6): 1081-90.

11. Izmailov D. Yu., Demin E. M., Vladimirov Yu. A. Određivanje antioksidativne aktivnosti mjerenjem kinetike hemiluminiscencije. Fotobiologija i fotomedicina. 2011; 7(2):70-6.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Luminol luminescencija izazvana 2,2"-Azo-bis(2-amidinopropan) termolizom. Besplatno

Radić Res Commun. 1992; 17(5): 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. O upotrebi gašenja luminolne luminiscencije za procjenu aktivnosti SOD. Free Radic Biol Med. 1994 Jun; 16(6): 833-7.

15. Lissi EA, Salim-Hanna M, Pascual C, Del Castillo MD. Procjena ukupnog antioksidativnog potencijala (TRAP) i ukupne antioksidativne reaktivnosti iz mjerenja hemiluminiscencije pojačane luminolom. Free Radic Biol Med. Feb 1995; 18(2):153-8.

17. Cormier MJ, Prichard PM. Istraživanje mehanizma luminiscentne peroksidacije luminola tehnikama zaustavljenog toka. J Biol Chem. 1968 Sep 25; 243(18): 4706-14.

21. Aleksejev A. V., Proskurnina E. V., Vladimirov Yu. A. Određivanje antioksidanata aktiviranom hemiluminiscencijom pomoću 2,2'-azo-bis(2-amidinopropana) Bilten Moskovskog državnog univerziteta. Ser. 2. Khim. 2012; 53 ( 3): 187-93.

24. Ministarstvo zdravlja SSSR Državna farmakopeja SSSR XI izd. Problem. 2 “Opšte metode analize. Ljekoviti biljni materijal". M.: Medicina; 1987. str. 147-8.

25. Sergunova E.V., Sorokina A.A., Kornyushina M.A. Studija preparata ekstrakta šipka. Pharmacy. 2012; (2): 14-6.

26. Sergunova E. V., Sorokina A. A., Avrach A. S. Proučavanje plodova gloga u različitim načinima čuvanja i ekstrakcije vode. Pharmacy. 2010; (5): 16-8.

27. Avrach A. S., Sergunova E. V., Kuksova Ya. V. Biološki aktivne supstance plodova i vodenih ekstrakata obične maline. Pharmacy. 2014; (1): 8-10.

28. Avrach A. S., Samylina I. A., Sergunova E. V. Proučavanje biološki aktivnih supstanci plodova gloga - sirovine za pripremu homeopatskih matričnih tinktura. On Sat. naučnim tr. Na osnovu materijala XXIV Mosk. intl. homeopata. konf. "Razvoj homeopatske metode u savremenoj medicini"; 24-25. januara 2014; Moskva. M.; 2014. str. 146-7.

29. Sergunova E. V., Sorokina A. A. Proučavanje sastava biološki aktivnih supstanci u ljekovitim biljnim sirovinama različitih metoda konzerviranja. On Sat. sažeci bazirani na XX Ross. nat. kongr. "Čovjek i lijek"; 15-19. aprila 2013.; Moskva. Moskva: EkoOnis; 2013. str. 184-90.

30. Alexandrova E. Yu., Orlova M. A., Neiman P. L. Proučavanje aktivnosti peroksidaze u ekstraktima iz rizoma i korijena hrena i njegove stabilnosti na različite utjecaje. Vestn. Moskovski državni univerzitet. Ser. 2. Chem. 2006; 47(5):350-2.

1. Proskurnina EV, Vladimirov YuA. Free radikaly kak uchastniki regulyatornykh i patologicheskikh protsessov. U: Grigor "ev AI, Vladimirov YuA, urednici. Fundamental" nye nauki - meditsine. Biofizicheskie meditsinskie tehnologii. Moskva: MAKS Press; 2015.v. 1. str. 38-71. ruski.

2. Chanda S, Dave R. In vitro modeli za procjenu antioksidativne aktivnosti i neke ljekovite biljke koje posjeduju antioksidativna svojstva: pregled. Afr J Microbiol Res. Dec 2009; 3(13): 981-96.

3. Khasanov VV, Ryzhova GL, Mal "tseva EV. Metody issledovaniya antioksidantov. Khimija Rastitel "nogo Syr" ja. 2004; (3): 63-75. Russian.

4. Vasil "ev RF, K" "ncheva VD, Fedorova GF, B" "tovska DI, Trofimov AV. Antioksidantnaya aktivnost" khalkonov. Khemilyuminestsentnoe opredelenie reakcione sposobnosti i kvantovsko-himičeskij raschet energii i stroeniya reagentov i intermediatov. Kinetika i kataliza. 2010; 51(4): 533-41. ruski.

5. Slavova-Kazakova AK, Angelova SE, Veprintsev TL, Denev P, Fabbri D, Dettori MA, et al. Antioksidativni potencijal spojeva povezanih s kurkuminom proučavan kinetikom hemiluminiscencije, efikasnošću prekida lanca, aktivnošću čišćenja (ORAC) i DFT proračunima. Beilstein J Org Chem. 2015. 11. aug; 11:1398-411.

6. Fedorova GF, Trofimov AV, Vasiljev RF, Veprintsev TL Hemiluminiscencija posredovana peroksi radikalima: mehanička raznolikost i osnove antioksidativnog testa, Arkivoc, 2007, 8: 163-215.

7. Fedorova GF, Menshov VA, Trofimov AV, Vasil'ev RF Lagani hemiluminiscencijski test za antioksidativna svojstva biljnih lipida: osnove i ilustrativni primjeri Analyst, Oct 2009, 134 (10): 2128-34.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Procjena antiradikalnog kapaciteta pomoću luminola izazvanog H2O2-heminom

9. Vladimirov YuA, Proskurnina EV. Besplatno radikaly i kletochnaya khemilyuminestsentsiya. Usp Biol Khim. 2009; 49:341-88. ruski.

10. Vladimirov YuA, Proskurnina EV, Izmailov DYu. Kineticheskaya khemilyuminestentsiya kao metod izučeniâ reaktsii svobodnykh radikalov. biofizika. 2011; 56(6): 1081-90. ruski.

11. Izmailov DYu, Demin EM, Vladimirov YuA. Opredelenie aktivnosti antioksidantov metodom izmereniya kinetiki khemilyuminestsen-tsii. Fotobiologiya i fotomeditsina. 2011; 7(2):70-6. ruski.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Luminol luminescencija izazvana 2.2"-Azo-bis(2-amidinopropan) termolizom. Free Radic Res Commun. 1992; 17 (5): 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. O upotrebi gašenja luminolne luminiscencije za procjenu aktivnosti SOD. Free Radic Biol Med. 1994 Jun; 16(6): 833-7.

14. Lissi EA, Escobar J, Pascual C, Del Castillo MD, Schmitt TH, Di Mascio P. Vidljiva hemiluminiscencija povezana s reakcijom između methemoglobina ili oksihemoglobina sa vodonik peroksidom. Photochem Photobiol. Nov 1994; 60(5):405-11.

16. Landi-Librandi AP, de Oliveira CA, Azzolini AE, Kabeya LM, Del Ciampo JO, Bentley MV, et al. In vitro procjena antioksidativne aktivnosti lipozomalnih flavonola pomoću HRP-H2O2-luminol sistema. J Microencapsul. 2011; 28(4):258-67.

17. Cormier MJ, Prichard PM. Istraga mehanizma

luminiscentne peroksidacije luminola tehnikama zaustavljenog protoka. J Biol Chem. 1968 Sep 25; 243(18): 4706-14.

18. Chang CL, Lin CS, Lai GH. Fitokemijske karakteristike, aktivnosti uklanjanja slobodnih radikala i neuroprotekcija pet ekstrakata ljekovitih biljaka. Evid Based Complement Alternat Med. 2012; 2012: 984295. doi: 10.1155/2012/984295. Epub 2011, 10. avgust.

19. Chang CL, Lin CS. Fitokemijski sastav, antioksidativna aktivnost i neuroprotektivni učinak ekstrakta Terminalia chebula Retzius. Evid Based Complement Alternat Med. 2012; 2012: 125247. doi: 10.1155/2012/125247. Epub 2011, 5. jul.

20. Georgetti SR, Casagrande R, Di Mambro VM, Azzolini AE, Fonseca MJ. Procjena antioksidativne aktivnosti različitih flavonoida metodom hemiluminiscencije. AAPS PharmSci. 2003; 5(2):111-5.

21. Alekseev AV, Proskurnina EV, Vladimirov YuA. Opredelenie antioksidantov metodom aktivirovannoi hemilyuminestsentsii s ispol "zovaniem 2.2" -azo-bis (2-amidinopropana). Bilten Moskovskog univerziteta za hemiju. 2012; 53(3): 187-93. ruski.

22. Pogačnik L, Ulrih NP. Primena optimizovanog testa hemiluminiscencije za određivanje antioksidativnog kapaciteta biljnih ekstrakata. Luminescencija. 2012. novembar-dec; 27(6):505-10.

23. Saleh L, Plieth C. Ukupni antioksidansi niske molekularne težine kao zbirni parametar, kvantificirani u biološkim uzorcima testom inhibicije hemiluminiscencije. Nat Protocol. 2010 Sep; 5(10): 1627-34.

24. Ministerstvo zdravookhraneniya SSSR. Gosudarsvennaya farmakopeya SSSR. 11th ed. br. 2. "Obshchie metody analysis.

Lekarstvennoe rastitel "noe syr" e", Moskva: Medltsina, 1987, str. 147-8. Russian.

25. Sergunova EV, Sorokina AA, Kornyushina MA. Izuchenie ekstraktsionnykh preparatov shipovnika. Pharmacy. 2012; (2): 14-6. ruski.

26. Sergunova EV, Sorokina AA, Avrach AS. Izučenie plodov boyaryshnika razlichnykh sposobov konservatsii i vodnykh izvlechenii. Farmatsia. 2010; (5): 16-8. ruski.

27. Avrach AS, Sergunova EV, Kuksova YaV. Biologicheski aktivnye veshchestva plodov i vodnykh izvlechenii maliny obyknovennoi. Farmatsia. 2014; (1): 8-10. ruski.

28. Avrach AS, Samylina IA, Sergunova EV. Izuchenie biologicheski aktivnykh veshchestv plodov boyaryshnika - syr "ya dlya prigotovleniya nastoek gomeopaticheskikh matrichnykh. Zbornik radova 14. Moskovske međunarodne homeopatske konferencije "Razvitie gomeopaticheskogo metoda v sovremennoi meditsine".

29. Sergunova EV, Sorokina AA. Izučenie sostava biologicheski aktivnykh veshchestv v lekarstvennom rastitel "nom syr" e razlichnykh sposobov konzervatsii. Zbornik radova 20. ruskog nacionalnog kongresa "Čelovek i lekarstvo"; 2013. april 1519; Moskva. Moskva: EkOOnis; 2013. str. 184-90. ruski.

30. Aleksandrova EYu, Orlova MA, Neiman PL. Izučenie peroksidaznoi aktivnosti v ekstraktah iz kornevišcha i kornei khrena i ee stabil "nosti k različitim vozdejstvima. Chemistry Bulletin Moskovskog univerziteta. 2006; 47 (5): 350-2. Russian.

diplomski rad

1.4 Metode istraživanja antioksidansa

antioksidativna aktivnost se klasifikuju: prema metodama registracije ispoljene AOA (volumetrijska, fotometrijska, hemiluminiscentna, fluorescentna, elektrohemijska); prema vrsti izvora oksidacije; prema vrsti oksidiranog spoja; prema metodi mjerenja oksidiranog spoja.

Međutim, najpoznatije metode za određivanje antioksidativne aktivnosti su:

1 TEAC (trolox ekvivalentni antioksidativni kapacitet): metoda se zasniva na sljedećoj reakciji:

Metmioglobin + H 2 O 2 > Ferrylglobin + ABTS > ABTS * + AO.

Metoda ekvivalencije Troloxa (TEAC) zasniva se na sposobnosti antioksidanata da smanje katione 2,2-azinobis radikala (ABTS) i na taj način inhibiraju apsorpciju u dijelu spektra duge talasne dužine (600 nm). Značajan nedostatak metode je dvostepena reakcija dobivanja radikala. Ovo produžava vrijeme analize i može povećati rasipanje rezultata, uprkos činjenici da se za analizu koristi standardizirani set reagensa.

2 FRAP (antioksidativna moć redukcije željeza): metoda se zasniva na sljedećoj reakciji:

Fe(III)-Tripiridiltriazin+AO>Fe(II)-Tripiridiltriazin.

Kapacitet smanjenja gvožđa/antioksidativni kapacitet (FRAP). Ovdje se koristi reakcija redukcije Fe(III)-tripiridiltriazina u Fe(II)-tripiridiltriazin. Međutim, ova metoda ne može odrediti neke antioksidanse, kao što je glutation. Ova metoda omogućava direktno određivanje antioksidansa niske molekularne težine. Pri niskom pH, redukcija Fe(III) tripiridiltriazinskog kompleksa u Fe(II) kompleks je praćena pojavom intenzivne plave boje. Mjerenja se zasnivaju na sposobnosti antioksidansa da potisnu oksidativni učinak reakcionih čestica nastalih u reakcijskoj smjesi. Ova metoda je jednostavna, brza i jeftina u izvođenju.

3 ORAC (kapacitet apsorpcije radikala kisika): metoda se zasniva na sljedećoj reakciji:

Fe (II) + H 2 O 2 > Fe (III) + OH * + AO> OH * + Luminol.

Određivanje sposobnosti apsorpcije kisikovih radikala (ORAC). U ovoj metodi se bilježi fluorescencija supstrata (fikoeritrin ili fluorescein), koja nastaje kao rezultat njegove interakcije sa ROS. Ako u uzorku za ispitivanje postoje antioksidansi, onda se uočava smanjenje fluorescencije u odnosu na kontrolni uzorak. Ovu metodu je prvobitno razvio dr. Guohua Cao na Nacionalnom institutu za starenje 1992. godine. Godine 1996. dr. Cao se pridružio dr. Ronaldu Pryeru u zajedničkoj grupi u USDA istraživačkom centru za starenje, gdje je bila poluautomatska metoda. razvijen.

4 TRAP (ukupni parametar antioksidansa za hvatanje radikala): metoda se zasniva na sljedećoj reakciji:

AAPH+AO>AAPH* + PL (PE).

Ova metoda koristi sposobnost antioksidansa da interaguju sa peroksil radikalom 2,2-azobis(2-amidinopropan) dihidrokloridom (AAPH). TRAP modifikacije se sastoje od metoda za registraciju analitičkog signala. Najčešće, u završnoj fazi analize, AAPH peroksi radikal interagira sa luminiscentnim (luminol), fluorescentnim (dihlorofluorescein diacetat, DCFH-DA) ili drugim optički aktivnim supstratom.

Derivat vitamina E rastvorljiv u vodi Trolox (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkroman-2-karboksi kiselina) koristi se kao standard za TEAC, ORAC i TRAP metode.

U posljednje vrijeme se povećao interes za korištenje elektrohemijskih metoda za procjenu antioksidativne aktivnosti. Ove metode su vrlo osjetljive i brze analize.

Procjena antioksidativne aktivnosti nekih prehrambenih proizvoda vrši se potenciometrijskom metodom, koja se temelji na korištenju svojstva antioksidativnih supstanci da učestvuju u redoks reakcijama zbog enol (-OH) i sulfhidril (-SH) grupa.

Određivanje antioksidativnih svojstava rastvora zasniva se na hemijskoj interakciji antioksidansa sa posredničkim sistemom, što dovodi do promene njegovog redoks potencijala. Elektrohemijska ćelija je kontejner koji sadrži rastvor K-Na-fosfatnog pufera, posrednički sistem Fe(III)/Fe(II) i kompleksnu elektrodu pre merenja redoks potencijala. Antioksidativna aktivnost se procjenjuje u g-eq/L.

Amperometrijska metoda za određivanje antioksidativne aktivnosti zasniva se na mjerenju električne struje koja nastaje prilikom oksidacije ispitivane supstance na površini radne elektrode koja je pod određenim potencijalom. Osjetljivost amperometrijske metode određena je i prirodom radne elektrode i potencijalom koji se na nju primjenjuje. Granica detekcije amperometrijskog detektora polifenola, flavonoida na nivou nano-pikograma, pri tako niskim koncentracijama, manja je vjerovatnoća međusobnog utjecaja različitih antioksidanata u njihovom zajedničkom prisustvu, a posebno manifestacija fenomena sinergizma . Nedostaci metode uključuju njenu specifičnost: u ovim uvjetima antioksidansi koji su sami oksidirani ili reducirani u području potencijala elektroredukcije kisika ne mogu se analizirati. Prednosti metode uključuju njenu brzinu, prostatu i osjetljivost.

Metoda galvanostatske kulometrije pomoću elektrogenerisanih oksidanata - metoda je primenljiva na analizu antioksidanata rastvorljivih u mastima.

Razvijene su različite metode za određivanje askorbinske kiseline:

amperometrijska metoda koja koristi aluminijsku elektrodu modificiranu filmom nikl(II) heksacijanoferata jednostavnom metodom uranjanja u otopinu;

metoda za spektrofotometrijsko i vizuelno određivanje askorbinske kiseline u čvrstoj fazi pomoću kserogela silicijumske kiseline modifikovanog Wawelovim reagensom i bakrom (II) kao indikatorskim prahom;

hemiluminiscentno određivanje askorbinske kiseline može se izvesti metodom protočne injekcije prema hemiluminiscentnoj reakciji rodamina B sa cerijumom (IV) u mediju sumporne kiseline.

određivanje askorbinske kiseline u rasponu od 10 -8 -10 -3 g/cm 3 anodnom voltametrijom u vodenim i vodeno-organskim medijima.

Najčešća je FRAP metoda, jer je ekspresna, visoko osjetljiva. U proteklih nekoliko decenija razvijen je veliki broj varijeteta metoda za određivanje antioksidativne aktivnosti FRAP metodom (tabela 1).

Tabela 1 Razvoj FRAP metode i njena primjena za određivanje antioksidativne aktivnosti različitih objekata

	Objekti analize	Bilješke
	krvna plazma	t=4min. Proučavana je stehiometrija reakcije i aditivnost.
	Čaj, vino	Određivanje AOA zbog polifenola
		Uspoređuju se AOA vrijednosti različitih vrsta čajeva
Pulido, Bravo, Saura-Calixto	Modelska rješenja	t=30min. Otkriven je uticaj nevodenog rastvarača
	Biljke
	krv, tkivo	PIA metoda. Provjeren je uticaj stranih materija.
Firuzi, Lacanna, Petrucci e.a.	Modelska rješenja	Proučavana je osjetljivost određivanja različitih AO u funkciji njihove strukture i redoks potencijala.
Katalinić, Miloš,	Razna vina
Temerdašev, Tsyupko i drugi.	Model mješavine
Loginova, Konovalova	Lijekovi. Pripreme	metoda ispitivanja
Temerdašev, Tsyupko i drugi.	Crvena suva vina	Korelacija AOA sa ostalim pokazateljima kvaliteta vina
Tabela 1 se nastavlja
	Model mješavine	Osetljivost određivanja različitih AO
Veršinjin, Vlasova, Tsyupko	Model mješavine	Otkrivena je neaditivnost signala sa nedostatkom oksidacionog sredstva
Anisimović, Deineka i drugi.	Modelska rješenja	Predloženi su kinetički parametri za procjenu AOA.

Napomene: konvencionalno označeno: PIA-flow-injection analiza, TPTZ-tripiridiltriazin, DIP-2,2, -dipiridil, PHEN-o-fenantrolin, DPA-piridindikarboksilna kiselina, FZ-ferozin, AA-askorbinska kiselina, CT-katehol, t - vrijeme ekspozicije, min.

Interakcija između proteina i polielektrolita u vodenim otopinama

Za karakterizaciju proteinsko-polielektrolitnih kompleksa koriste se različite metode analize. Instrumentalne metode daju informacije o strukturnim i optičkim svojstvima, kao i određuju dinamiku i prirodu PEC vezivanja...

Utjecaj d-metalnih spojeva na brzinu disocijacije molekula vode u bipolarnoj membrani

U procesu sinteze novih BPM-a veliku pažnju treba posvetiti proučavanju svojstava dobijenih uzoraka za kasniji izbor uslova sinteze koji obezbeđuju poboljšanje elektrohemijskih karakteristika sintetizovanih membrana...

Dizajnerske droge i sintetički kanabinoidi

Detekcija sintetičkih kanabinoida u biljnim mješavinama može se izvesti različitim fizičko-hemijskim metodama, kao što su plinska hromatografija-masena spektrometrija, plinska, tankoslojna i tečna hromatografija visokih performansi...

Razvoj metode za određivanje flavonoida u ljekovitom biljnom materijalu

Sinteza i farmakološka svojstva kinolinona-2

Predmet istraživanja: Kinolinon-2. Metoda istraživanja: Pomoću kompjuterskog programa „Marvin JS“ kreirana je struktura supstance. Zatim je poslata na sajt "http://www.way2drug.com/PASSOnline/predict.php" radi dalje istrage...

Termospektralna metoda za proučavanje produkata isparavanja epoksidnog polimera

Tehnologija za dobijanje visoko prečišćenog hitozana iz ljuske rakova

Određivanje molekulske mase hitozana Molekularna težina hitozana određena je viskozometrijski prema standardnoj proceduri. Rastvori koncentracije 0,05 i 0,5 g/dl pripremljeni su otapanjem izvaganog dijela polimernog praha u acetatnom puferu (0...

Fizičko-geografske karakteristike teritorije parka prirode

Pronalazak se odnosi na prehrambenu industriju i može se koristiti za određivanje ukupne antioksidativne aktivnosti. Metoda se izvodi na sljedeći način: analit stupa u interakciju sa reagensom 0,006 M Fe(III) - 0,01 M o-fenantrolin. Askorbinska kiselina (AA) stupa u interakciju sa istim reagensom, koji se dodaje u omjeru 1:100. Zatim se inkubira najmanje 90 minuta i fotometrira na 510±20 nm. Nakon toga se utvrđuje zavisnost vrednosti analitičkog signala od količine supstance i izračunava vrednost ukupnog AOA. Prikazana metoda omogućava manje dugotrajno i pouzdanije određivanje ukupne antioksidativne aktivnosti biljnog materijala i prehrambenih proizvoda na bazi njega. 2 w.p. f-ly, 1 ill., 5 tab.

Pronalazak se odnosi na analitičku hemiju i može se koristiti za određivanje ukupne antioksidativne aktivnosti (AOA) biljnog materijala i prehrambenih proizvoda na bazi njega.

Poznata kulometrijska metoda za određivanje ukupnog AOA čaja, zasnovana na interakciji vodenih ekstrakata proizvoda s elektrogeneriranim jedinjenjima broma (I.F. Abdulin, E.N. Turova, G.K. Budnikov Kulometrijska procjena antioksidativnog kapaciteta ekstrakta čaja elektrogeneriranim bromom // Zhurn Hemija, 2001, tom 56, br.6, str.627-629). Izbor elektrogenerisanih jedinjenja broma kao titranta je zbog njihove sposobnosti da uđu u različite reakcije: radikalne, redoks, elektrofilne supstitucije i adicije višestrukim vezama. Ovo omogućava pokrivanje širokog spektra biološki aktivnih jedinjenja čaja sa antioksidativnim svojstvima. Nedostaci metode su mogućnost reakcije bromiranja sa supstancama koje nisu antioksidansi, te izražavanje rezultirajuće vrijednosti ukupne AOA u jedinicama količine električne energije (kC/100 g), što otežava procjenu rezultati.

Poznata voltametrijska metoda za određivanje ukupne antioksidativne aktivnosti relativnom promjenom struje elektroredukcije kisika u rasponu potencijala od 0,0 do -0,6 V (rel. sat. c.s.e.) na elektrodi sa živinim filmom (Pat. IPC 7 G 01 N 33/01 Voltametrijska metoda za određivanje ukupne aktivnosti antioksidanata / E. I. Korotkova, Yu. Nedostatak ove metode je pojava sporednih elektrohemijskih reakcija, što smanjuje efikasnost određivanja antioksidansa, što dovodi do smanjenja pouzdanosti rezultata.

Poznata metoda za kontrolu ukupne AOA profilaktičkih i terapijskih antioksidativnih sredstava za lipidnu peroksidaciju u malonski aldehid sa spektrofotometrijskom ili hemiluminiscentnom detekcijom (Pat. 2182706, Rusija, IPC 7 G 01 N 33/15, 33/52. fondova / I Pavlyuchenko I. Basov A.A., Fedosov S.R. - br. 2001101389/14; prijava 15.01.2001; objavljena 20.05.2002. Istovremeno, antioksidativna aktivnost je obrnuto proporcionalna nivou produkata peroksidacije lipida. Nedostatak ove metode može se smatrati ograničenim opsegom analiziranih objekata, jer se u tim uslovima određuju antioksidansi samo jedne grupe, lipidi.

Poznata metoda za određivanje ukupne AOA biljnog ekstrakta, koja se sastoji u inkubiranju ekstrakta s linetolom i željezovim (II) sulfatom, pokretanju reakcije oksidacije UV zračenjem i naknadnoj interakciji sa tiobarbiturnom kiselinom u prisustvu tritona X-100 ( Aplikacija 97111917/13, Rusija, IPC 6 G 01 N 33/00 Metoda za određivanje ukupne antioksidativne aktivnosti / Rogozhin VV - Prijava 08.07.1997; objavljeno 10.06.1999). Prilikom izvođenja spektrofotometrije koristi se mješavina etanola i kloroforma u omjeru 7:3. AOA vrijednost biološkog materijala određena je omjerom akumulacije produkta reakcije - malondialdehida u uzorku koji sadrži ekstrakt prema uzorku s prooksidansom. Nedostatak ove metode je u mogućnosti nuspojava pri UV zračenju, što smanjuje pouzdanost rezultata analize.

Navedene metode za određivanje ukupnog AOA imaju niz nedostataka: visok intenzitet rada, nisku pouzdanost, izmjerena vrijednost ukupnog AOA nije povezana i nije uporediva sa bilo kojom konvencionalnom supstancom.

Najbliži analog predmetnom pronalasku je metoda za određivanje ukupnog AOA ljekovitog bilja mjerenjem hemiluminiscencije koja se javlja pri reakciji sa luminolom u prisustvu oksidirajućeg agensa vodikov peroksid (M.Kh. kanarinska trava kemiluminiscencijom // Journal of Analitička hemija, 2004, V.59, br. 1, str.84-86). Za kvantitativnu procjenu ukupne AOA upoređena je redukciona sposobnost ekstrakta ljekovitih sirovina i aktivnost snažnog antioksidansa – askorbinske kiseline u količini od 25-110 μg. U poređenju sa gore navedenim metodama, u prototipu se vodikov peroksid koristi kao oksidaciono sredstvo, u interakciji sa širokim spektrom antioksidanata, a izmerena vrednost ukupne AOA objekta se određuje i izražava u odnosu na askorbinsku kiselinu koja je uobičajeni antioksidans, koji omogućava postizanje pouzdanih rezultata uz zadržavanje drugih nedostataka. Nedostaci također uključuju složenost opreme koja se koristi u metodi.

Tehnički cilj predmetnog pronalaska je razvoj manje dugotrajne i pouzdane metode za određivanje ukupne antioksidativne aktivnosti biljnih materijala i prehrambenih proizvoda na bazi njih.

Za rješavanje tehničkog problema predlaže se interakcija analita sa reagensom 0,006 M Fe (III) - 0,01 M o-fenantrolin i askorbinske kiseline (AA) sa istim reagensom koji se dodaje u omjeru 1:100. , inkubiran najmanje 90 minuta, fotometriran na 510±20 nm, nakon čega se utvrđuje zavisnost analitičkog signala od količine supstance i izračunava ukupna AOA. Konkretno, proračun se može provesti prema formuli (I), izvedenoj iz jednadžbe kvantitativne korespondencije između objekta koji se proučava i askorbinske kiseline:

gdje su a, b koeficijenti u regresionoj jednadžbi za ovisnost analitičkog signala o količini AA;

a", c" - koeficijenti u regresionoj jednadžbi za zavisnost analitičkog signala od količine objekta koji se proučava;

x sunce. - masa ispitivanog redukcionog sredstva (uzorka), mg.

Upotreba predloženog reagensa u ovim uslovima omogućila nam je proširenje linearnog opsega i smanjenje donje granice utvrđenih količina askorbinske kiseline. Predloženi skup bitnih karakteristika omogućava vam da odredite ukupni AOA širokog spektra biljnih materijala i prehrambenih proizvoda na osnovu njega.

Kvantitativne korespondentne jednačine povezuju zavisnost analitičkog signala o količini askorbinske kiseline i zavisnost analitičkog signala o količini ispitivanog objekta, pod uslovom da je antioksidativna aktivnost jednaka.

Nakon obrade rezultata fotometrijskih mjerenja veličine analitičkog signala metodom najmanjih kvadrata (K. Derffel Statistics in analitičke hemije. - M.: "Mir", 1994. S. 164-169; A.K. Charykov Matematička obrada rezultati hemijske analize - L .: Chemistry, 1984. S.137-144) ove zavisnosti su opisane linearnom regresijskom funkcijom: y=ax+b, gde je a koeficijent regresije, b je slobodni član. Koeficijent a u jednadžbi regresije jednak je tangenti nagiba prave linije prema x-osi; koeficijent b - rastojanje duž y-ose od početka (0,0) do prve tačke (x 1 , y 1).

Koeficijenti a i b se izračunavaju po formulama:

Jednačina regresije za ovisnost AS o količini askorbinske kiseline u datom trenutku ima oblik:

y AK \u003d a x AK (mg) + b,

jednadžba regresije za ovisnost AS o količini predmeta koji se proučava (reducirajući agens):

y VOST \u003d a "x VOST (mg) + b",

gdje je za AK, za VOST optička gustina fotometrijskog rješenja;

x AK (mg), x VOST (mg) - koncentracija askorbinske kiseline (reduktora) u rastvoru;

zatim, izjednačavanjem vrijednosti funkcija, dobijamo formulu (I) za izračunavanje antioksidativne aktivnosti objekta koji se proučava u jedinicama količine (mg) askorbinske kiseline.

Na crtežu je prikazana zavisnost analitičkog signala od količine redukcionog agensa.

Optička gustina analiziranih rastvora merena je fotoelektričnim kolorimetrom KFK-2MP.

Poznato je (F. Umland, A. Yasin, D. Tirik, G. Vunsch Kompleksna jedinjenja u analitičkoj hemiji - M.: Mir, 1975. - 531 str.) da o-fenantrolin formira kelat rastvorljiv u vodi sa gvožđem ( II) crveno-narandžasta boja, koju karakteriše apsorpcioni maksimum na λ=512 nm. Stoga se u predloženoj metodi fotometrija izvodi na λ=510±20 nm.

Optimizacija sastava reagensa i njegove količine unesene u reakciju izvršena je na osnovu rezultata multifaktorskog planiranja eksperimenta metodom Latinskog kvadrata, koja se sastojala u promjeni svih proučavanih faktora u svakom eksperimentu, a svaki nivo svakog faktora samo jednom ispunjava različite nivoe drugih faktora. Ovo vam omogućava da identifikujete i procenite efekat koji izaziva svaki faktor koji se proučava zasebno.

Korišteni su sljedeći faktori: količine Fe(III), o-fenantrolina i zapremina reagensa unesenog u reakciju. Kombinacija faktora treba da obezbedi širok opseg linearnosti analitičkog signala (AS) sa dovoljnom osetljivošću, s jedne strane, i stabilnošću reagensa tokom vremena, s druge strane. To je omogućilo da se za svaki faktor izdvajaju sljedeći nivoi:

količina Fe(III): 0,003 M (A 1); 0,006 M (A 2); 0,009 M (A 3);

količina o-fenantrolina: 0,01 M (B 1); 0,02 M (B 2); 0,03 M (B 3);

zapremina reagensa: 0,5 ml (C 1); 1,0 ml (C 2); 2,0 ml (C 3) (Tabela 1).

Za izbor optimalne kombinacije nivoa faktora dobijene su kalibracione zavisnosti AS od količine askorbinske kiseline u rasponu od 10 do 150 μg (što je neophodno za potvrdu linearnosti funkcije), regresiona jednačina dobijene zavisnosti je dobijena izračunati, a zatim i vrijednost AS pri datoj količini (120 μg) askorbinske kiseline. Tako je za svaki sastav reagensa (faktori A, B) odabran volumen (faktor C) pri kojem je AC vrijednost maksimalna. To je omogućilo da se broj razmatranih kombinacija smanji na devet (tablica 2).

Upoređujući ukupni AS za svaki nivo, identifikovani su iznosi sa maksimalnom vrednošću: ΣA 2 (0,991); ΣB 1 (1.066); ΣC 2 (1.361). Ovo je omogućilo da se zaključi da je sastav reagensa optimalan: 0,006 M Fe (III) - 0,01 M o-fenantrolin sa svojom zapreminom uvedenom u reakciju, 1,0 ml na 100 ml rastvora.

Pri optimalnoj koncentraciji reagensa proučavali smo promjenu zavisnosti AS od koncentracije askorbinske kiseline i nekih reduktora uobičajenih u prirodnim objektima (tanin, rutin, kvercetin) u različitim vremenima inkubacije reakcione smjese (30, 60). , 90, 120 min). Utvrđeno je da je za sve proučavane redukcione agense zavisnost AS od njihovog sadržaja linearna u rasponu od 10-150 μg (vidi crtež), a vrednost AS zavisi od vremena inkubacije (tabela 3).

Iz crteža se vidi da je promjena AC pod djelovanjem rutina neznatna, tanin se približava, a kvercetin premašuje istu ovisnost za askorbinsku kiselinu. Uzimajući u obzir promjenu AC od vremena inkubacije za sve proučavane redukcijske agense (tabela 3), utvrđeno je da se stabilizacija analitičkog signala tokom vremena opaža od 90 minuta.

Tabela 3 Promjena AS redukcionih agenasa tokom vremena
Ispitna supstanca	m tvari, mg / cm 3	Analitički signal
Ispitna supstanca	m tvari, mg / cm 3	Vrijeme inkubacije reakcione smjese, min
30	60	90	120
vitamin C	10	0,038	0,042	0,044	0,044
100	0,340	0,352	0,360	0,363
Tanin	10	0,029	0,037	0,042	0,043
100	0,280	0,295	0,303	0,308
Rutin	10	0,013	0,016	0,019	0,019
100	0,150	0,166	0,172	0,175
kvercetin	10	0,031	0,044	0,051	0,053
100	0,420	0,431	0,438	0,442

Da bi se dokazala sumirajuća priroda utvrđene AOA vrijednosti, proučavan je učinak reagensa Fe (III) - o-fenantrolina na modelne otopine, koje su uključivale redukcijske agense: tanin, rutin, kvercetin i askorbinsku kiselinu u različitim omjerima. U tabeli 4 prikazani su rezultati analize modelskih mješavina.

Tabela 4 Rezultati analize modelskih mješavina (P=0,95; n=3)
Broj komponenti u smeši	Ukupna AOA, izračunata, mcgAA	Ukupan AOA, pronađen, mcgAA
uveden	Ukupna AOA, izračunata, mcgAA	Ukupan AOA, pronađen, mcgAA	u smislu AK
AK	Tanin	Rutin	kvercetin	AK	Tanin	Rutin	kvercetin
-	20	20	20	-	16,77	9,56	32,73	59,06	57,08
-	10	10	10	-	8,35	4,77	16,41	29,53	26,95
-	50	10	10	-	42,02	4,77	16,41	63,20	55,04
-	10	50	10	-	8,35	23,93	16,41	48,69	50,06
-	10	10	50	-	8,35	4,77	81,70	94,82	91,61
-	30	10	10	-	25,19	4,77	16,41	46,37	39,24
-	10	30	30	-	8,35	14,35	49,06	71,76	73,47
20	20	20	20	20	16,77	9,56	32,73	79,06	96,29
50	10	10	10	50	8,35	4,77	16,41	87,95	93,07
10	50	10	10	10	42,02	4,77	16,41	73,20	78,15
10	10	50	10	10	8,35	23,93	16,41	58,69	78,74
10	10	10	50	10	8,35	4,77	81,70	104,82	121,45
30	30	10	10	30	25,19	4,77	16,41	76,37	84,59
10	10	30	30	10	8,35	14,35	49,06	81,76	103,31

Proračun teorijske vrijednosti ukupne AOA izvršen je prema jednačinama kvantitativne korespondencije koje karakterišu antioksidativni kapacitet ispitivanog redukcionog agensa u odnosu na askorbinsku kiselinu, u uslovima jednake antioksidativne aktivnosti: .

Vrijednost eksperimentalnog (pronađenog) AOA izračunata je pomoću prosječne regresione jednačine za ovisnost AS od količine askorbinske kiseline. Iz rezultata prikazanih u tabeli 4 može se vidjeti da se eksperimentalno dobijene vrijednosti AOA zadovoljavajuće slažu sa teorijski izračunatim.

Dakle, utvrđena vrijednost AOA je ukupni indikator, a određivanje njegove vrijednosti pomoću jednačina kvantitativne korespondencije je ispravno.

Predložena metoda je testirana na stvarnim uzorcima. Da bi se odredio ukupni AOA stvarnog uzorka ili njegovog ekstrakta, dobijene su kalibracione zavisnosti AS od količine analita i askorbinske kiseline u vremenu inkubacije reakcione smeše od najmanje 90 minuta. Izračunavanje ukupnog AOA izvršeno je prema formuli (I) i izraženo u mg askorbinske kiseline po gramu ispitivanog objekta (mgAA/g).

Da bi se potvrdila ispravnost predložene metode, ovi uzorci su ispitani prema poznatim metodama, ocjenjivanjem sadržaja askorbinske kiseline (GOST 24556-89 Prerađevine od voća i povrća. Metode određivanja vitamina C) i preovlađujućih redukcionih sredstava: u čaju - tanin (GOST 19885-74 Čaj. Metode za određivanje sadržaja tanina i kofeina), u plodovima šipka - količina organskih kiselina (GOST 1994-93 Šipak. Specifikacije) (tabela 5).

1 Bolshakova L.S. jedanMilentiev V.N. 2Sannikov D.P. 3Kazmin V.M. 2

1 Oryolski državni institut za ekonomiju i trgovinu

2 Federalna državna budžetska ustanova "Centar za hemikalizaciju i poljoprivrednu radiologiju "Orlovsky"

3 Federalna državna budžetska obrazovna ustanova visokog stručnog obrazovanja "Državni univerzitet - obrazovni, naučni i industrijski kompleks"

Proučavana je mogućnost primjene hemiluminiscencije za procjenu antioksidativne aktivnosti prehrambenih supstanci. Predložena metoda se zasniva na hemiluminiscenciji luminola u alkalnoj sredini, čiji intenzitet zavisi od količine peroksida u hemiluminiscentnom uzorku. Hemiluminiscencija je snimljena korištenjem razvijene instalacije koja sadrži dozirnu pumpu, svjetlo-nepropusnu komoru, staklenu vakuumsku fotomultiplikatorsku cijev i kompjuterski sistem. Da bi se pojačala hemiluminiscencija, u luminol je dodan rastvor kalij-fericijanida. Promjene u intenzitetu hemiluminiscencije zabilježene su u trenutku unošenja analiziranog uzorka u otopinu luminola. Kao analizirani uzorak korišten je ekstrakt maslačka dobiven suhom niskotemperaturnom destilacijom. Sadrži fenolne spojeve poznate po visokoj antioksidativnoj aktivnosti. Utvrđeno je da se metoda hemiluminiscencije može koristiti za određivanje antioksidativnih svojstava različitih jedinjenja hrane.

Bibliografska veza

Panichkin A.V., Bolshakova L.S., Milentiev V.N., Sannikov D.P., Kazmin V.M. UPOTREBA KEMILUMINESCENCIJE ZA OCJENU ANTIOKSIDANTNIH SVOJSTVA HRANJIVIH MATERIJA // Racionalna prehrana, aditivi u hrani i biostimulansi. - 2014. - br. 6. - str. 36-37;
URL: http://journal-nutrition.ru/ru/article/view?id=283 (datum pristupa: 17.12.2019.). Predstavljamo Vam časopise koje izdaje izdavačka kuća „Akademija prirodne istorije“ 1 Milentiev V.N. 2Sannikov D.P. 3Kazmin V.M. 2

1 Oryolski državni institut za ekonomiju i trgovinu

2 Federalna državna budžetska ustanova "Centar za hemikalizaciju i poljoprivrednu radiologiju "Orlovsky"

3 Federalna državna budžetska obrazovna ustanova visokog stručnog obrazovanja "Državni univerzitet - obrazovni, naučni i industrijski kompleks"

hemiluminiscencija

antioksidativno djelovanje

peroksidi

hranljive materije

1. Vasiliev R.F. Hemijski sjaj // Kemija i kemičari, 21.01.10. – URL: http://chemistry-chemists.com. (datum pristupa: 22.08.13.).

2. Vladimirov Yu.A. Slobodni radikali i antioksidansi // Vestn. RAMN. - 1998. - br. 7. - Str. 43-51.

3. Kondrashova E.A. Hemiluminiscencija kao najosjetljivija metoda enzimskog imunotestiranja i njena primjena Kliničko-laboratorijska dijagnostika. - 1999. - br. 9. - Str. 32.

4. Lyubimov, G.Yu. Kemiluminiscentna analiza // Imunologija. - 1991. - br. 1. - Str. 40–49.

5. Mayansky A.N., Nevmyatullin A.L., Chebotar I.V. Reaktivna hemiluminiscencija u sistemu fagocitoze // Mikrobiologija. - 1987. - br. 1. - S. 109–115.

6. Sherstnev M.P. Putevi stvaranja ćelijske hemiluminiscencije, zavisni i od kalcijuma. - 1991. - br. 2. - S. 1–4.

Danas je hemiluminiscencija veliko područje nauke koje se nalazi na granici između hemije, fizike i biologije. Kod hemiluminiscencije dolazi do direktnog pretvaranja hemijske energije u energiju elektromagnetnih oscilacija, tj. u svijet. Pomoću hemiluminiscencije može se saznati kako se reakcija odvija, koji je njen mehanizam, neophodan za efikasno i racionalno odvijanje tehnoloških procesa. Ako je tehnološki proces dobivanja bilo kojeg kemijskog proizvoda praćen hemiluminiscencijom, tada njegov intenzitet može poslužiti kao mjera brzine procesa: što je reakcija brža, to je sjajniji sjaj. Tokom reakcije hemiluminiscencije dobijaju se energetski bogati produkti, koji zatim daju energiju emitovanjem svetlosti, odnosno hemijska energija se pretvara u energiju elektromagnetnog zračenja.

Cilj istraživanja bio je istražiti mogućnost korištenja hemiluminiscencije za procjenu antioksidativne aktivnosti prehrambenih supstanci.

Rezultati istraživanja i diskusija

Problem procjene antioksidativne aktivnosti prehrambenih supstanci je vrlo relevantan. Upotreba termina "antioksidativna aktivnost" kako bi se pokazala korisnost određenog proizvoda često se koristi bez ikakvih hemijskih i biohemijskih argumenata. U pravilu, antioksidativna aktivnost bilo koje tvari odnosi se na djelotvornost smanjenja peroksidne vrijednosti. Sam koncept peroksidne vrijednosti također ne otkriva u potpunosti njegovu kemijsku suštinu, budući da ne odgovara u potpunosti kinetici i termodinamici faza metabolizma određenog prehrambenog proizvoda. Osim toga, ova vrijednost se koristi za karakterizaciju lipida u obliku masti. Međutim, procesi oksidacije i stvaranja peroksida u tijelu se javljaju ne samo uz korištenje masti, već i kod drugih proizvoda. Drugim riječima, može se reći da je sadržaj peroksida u određenom proizvodu „izmjeren“ na nekoj vrsti vaga, gdje je „referentna težina“ jedinica koncentracije u kiseloj sredini jodidnog jona oksidiranog peroksidima, kao što je rezultat čega nastaje molekularni jod:

I- - e → I; (jedan)

I + I → I20. (2)

Kada se molekularni jod titrira otopinom koja sadrži natrijev tiosulfat, utvrđuje se njegova koncentracija i, posljedično, određuje količina oksidacijskih sredstava jodidnih jona, tj. peroksidnih spojeva, koji se zapravo nazivaju peroksidni broj. Određivanje peroksidne vrijednosti pomoću ove vrste "vaganja" zasniva se na reakciji prikazanoj na sl. jedan.

Rice. 1. Određivanje peroksidne vrijednosti pomoću natrijum tiosulfata

Dakle, koncentracija peroksida se određuje iz jednačine

S(I2) = ϒ(C[-O-O-]), (3)

gdje je ϒ koeficijent korelacije između koncentracije molekularnog joda i koncentracije peroksida.

Predložena metoda za određivanje peroksida u proizvodima zasniva se na hemiluminiscenciji luminola (C[lm]) u alkalnom mediju, čiji intenzitet (Ichl) zavisi od koncentracije peroksida (C[-O-O-]), u hemiluminiscentni uzorak:

IHL. = Ϧchl ω, (4)

gdje je Ϧchl kvantni prinos hemiluminiscencije; ω - brzina reakcije koja uključuje perokside:

khlC[-O-O-] C[lm] = ω, (5)

gdje je kchl konstanta brzine reakcije ili na:

C[lm] kchl Ϧchl = K, (6)

IHL = K C[-O-O-]. (7).

Količina peroksida (-O-O-) određena je svjetlosnom sumom (S):

Vrijednost S ovisi o stupnju potpunog trošenja peroksida u hemiluminiscentnoj reakciji.

Da bi se odredila konstanta K, konstruiše se kalibraciona kriva za zavisnost svetlosne sume S od koncentracije peroksida, koja se određuje titracijom:

S = f(C[-O-O-]). (devet)

Vodikov peroksid H2O2 se koristi kao peroksid.

Zatim se upoređuju podaci dobijeni iz jednačine (3) i (9). Na osnovu poređenja ϒ i K dolazi se do zaključka o slaganju reakcionih mehanizama koji su u osnovi određivanja peroksida ovim metodama. Utvrđeno je da se u ovom rasponu koncentracija peroksida ϒ i K zaista međusobno slažu i stoga se mogu koristiti za određivanje peroksidne vrijednosti.

Hemiluminiscencija je uočena u alkalnoj sredini koja sadrži luminol (5-amino-1,2,3,4-tetrahidro-1,4-ftalazindion, 3-aminoftalni hidrazid, H2L). Snimljen je pomoću hemiluminiscentne postavke, uključujući stakleni vakuum fotomultiplikator. Fotomultiplikator se napaja visokonaponskim ispravljačem (7) spojenim na blok (9) koji pojačava signal fotomultiplikatora, koji se snima na displeju monitora računara (5).

Rice. 2. Registracija hemiluminiscencije analiziranog proizvoda: 1 - dozirna pumpa; 2 - svjetlootporna komora; 3 - ogledalo; 4 - kiveta; 5 - kompjuterski sistem; 6 - fotomultiplikator; 7 - visokonaponski ispravljač; 8 - uređaj koji vam omogućava da odredite područje spektra hemiluminiscentnog zračenja; 9 - blok koji pojačava signal fotomultiplikatora

Dozirna pumpa (1) je potrebna za uvođenje analiziranog uzorka u kivetu (4) koja sadrži hemiluminiscentni rastvor luminola. Ovaj dozator djeluje kao miješalica za ubrizgani uzorak s hemiluminiscentnim rastvorom. Da bi se poboljšala brzina reakcije i intenzitet hemiluminiscencije, u luminol je dodan rastvor kalij-fericijanida. Miješanje se vrši pomoću mjehurića zraka dobivenih pumpanjem zraka kroz tekućinu otopine pomoću pumpe. Ogledalo (3) koje se nalazi u opak komori (2) služi za bolje sakupljanje svetlosti hemiluminiscentnog zračenja koje upada na fotokatodu fotomultiplikatora (6) postavljenog u opak komori. Dozator vam omogućava da unesete željene komponente tečnosti u kivetu bez otvaranja svetlo-nepropusne komore (2) tokom eksperimenata. U tom slučaju te tekućine ulaze u kivetu (4) kroz staklene ili plastične cijevi. Računarski sistem vam omogućava da registrujete zavisnost intenziteta luminiscencije I od vremena t, odnosno kinetiku hemiluminiscencije:

Kompjuterski sistem odražava konstante rasta i pada u funkciji I = f(t), koje su konjugirane sa konstantama brzine reakcija koje izazivaju hemiluminiscenciju, odnosno sa njihovom kinetikom. U hemiluminiscentnu komoru je uključen uređaj (8) koji omogućava određivanje spektralnog područja hemiluminiscentnog zračenja, odnosno zavisnosti:

I = f1(λ). (jedanaest)

Ovaj blok je kaseta u obliku diska, u koju su montirani granični filteri. Promena svetlosnih filtera se vrši okretanjem disk kasete oko horizontalne ose koja povezuje središta ravni svetlosnih filtera i ravni fotokatode fotomultiplikatora.

Proces mjerenja se izvodi na sljedeći način:

1. Postavlja se odgovor fotomultiplikatora na promjene napona napajanja i na promjene intenziteta referentnog izvora svjetlosti koji pada na njegovu katodu.

2. Kiveta se napuni rastvorom luminola u alkalnoj sredini.

3. Dozator se puni analiziranim uzorkom.

4. Snima se zavisnost intenziteta hemiluminiscencije od vremena t. Hemiluminiscencija se prati do vremena t1, u kojem je promjena I1 od vremena t minimalna: I1 = f1(t).

5. Dio analiziranog rastvora se unosi pomoću dozatora.

6. Uočena je hemiluminiscencija analiziranog uzorka čija je kinetika I = f(t).

Na sl. Na slici 3 prikazan je graf zavisnosti funkcija (I1 = f1(t)), konjugiran sa grafikom (I = f(t)), nakon uvođenja analiziranog rješenja.

Kao što se može vidjeti sa sl. 3, intenzitet hemiluminiscencije luminola se mijenja: nagli porast prati nagli pad luminescencije nakon dodavanja analiziranog uzorka.

Budući da je povećanje hemiluminiscencije tokom oksidacije luminola povezano sa stvaranjem peroksida, smanjenje intenziteta hemiluminiscencije nakon unošenja analiziranog uzorka ukazuje na smanjenje njihovog broja. Stoga se može govoriti o prisutnosti antioksidativne aktivnosti u spojevima koji čine analizirani uzorak.

Treba napomenuti da je kao analizirani uzorak korišten ekstrakt maslačka dobiven suhom niskotemperaturnom destilacijom, koji sadrži fenolne spojeve poznate po visokom antioksidativnom djelovanju.

Rice. Slika 3. Grafikon zavisnosti funkcija (I1 = f1(t)), konjugiranih sa grafom (I = f(t)), nakon uvođenja analiziranog rješenja

Osim toga, tokom eksperimenta je utvrđeno da je pomoću hemiluminiscencije moguće odrediti količinu peroksida u superrazrijeđenim sistemima, što je važno za procjenu početka oksidacije proizvoda, na primjer, tokom njihovog skladištenja.

Tako su provedena istraživanja pokazala da metoda za određivanje peroksida u proizvodima, zasnovana na kemiluminiscenciji luminola u alkalnom mediju, omogućava procjenu antioksidativne aktivnosti prehrambenih supstanci i može se koristiti za utvrđivanje antioksidativnih svojstava različitih namirnica. spojeva.

Recenzenti:

Litvinova E.V., doktor tehničkih nauka, profesor Katedre za tehnologiju, organizaciju i higijenu hrane, OrelGIET, Orel;

Kovaleva O.A., doktor bioloških nauka, direktor INIT-a, FSBEI HPE "Oryol State Agrarian University", Orel.

Rad je primljen u uredništvo 08. novembra 2013. godine.

Bibliografska veza

Panichkin A.V., Bolshakova L.S., Milentiev V.N., Sannikov D.P., Kazmin V.M. UPOTREBA KEMILUMINESCENCIJE ZA OCJENU ANTIOKSIDANTNIH SVOJSTVA HRANJIVIH MATERIJA // Fundamentalna istraživanja. - 2013. - br. 10-11. – S. 2436-2439;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=32810 (datum pristupa: 17.12.2019.). Predstavljamo Vam časopise koje izdaje izdavačka kuća "Academy of Natural History"