A Clinical Biochemist Reviews című folyóiratban megjelent áttekintés szerint a nagy teljesítményű folyadékkromatográfia tandem tömegspektrometriával (HPLC-MS/MS) kombinált alkalmazása a klinikai laboratóriumokban rendkívüli mértékben megnövekedett az elmúlt 10-12 évben. A szerzők megjegyzik, hogy a HPLC-MS/MS analízis specificitása szignifikánsan felülmúlja az immunológiai módszereket és a klasszikus nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát (HPLC) a kis molekulatömegű molekulák elemzésében, és lényegesen nagyobb áteresztőképességgel rendelkezik, mint a gázkromatográfiás-tömegspektrometria ( GC-MS). E módszer népszerűsége a rutin klinikai elemzésekben jelenleg a módszer egyedülálló képességeivel magyarázható.

A HPLC-MS/MS módszer fő előnyei:
• Kis molekulák pontos mennyiségi meghatározásának képessége;
• Több célvegyület egyidejű elemzése;
• Egyedülálló sajátosság;
• Magas elemzési sebesség.

Az elmúlt években nagy figyelmet fordítottak az elemzési időre, és ennek eredményeként a laboratórium termelékenységének javítására. Az elemzési idő jelentős csökkentését a rövid analitikai oszlopok HPLC/MS/MS-hez történő alkalmazása tette lehetővé, miközben drámai módon növelte az analízis specifitását. Az atmoszférikus nyomású ionizáció (API), a tandem hármas kvadrupólus tömegspektrométer és a fejlett, nagy teljesítményű folyadékkromatográfia és a kapcsolódó minta-előkészítési módszerek alkalmazása az LC/MS/MS-t a modern analitikai módszerek élvonalába hozták a klinikai kutatásban.

A HPLC/MS/MS fő alkalmazási területei a klinikai gyógyászatban:
• A szteroidok (szteroid panelek), purinok, pirimidinek és egyéb vegyületek metabolizmusának teljes profiljának megszerzése,
  újszülöttek szűrése veleszületett anyagcsere-hibákra (több tucat betegség kimutatása egy elemzésben);
• Gyógyszerek - immunszuppresszánsok, görcsoldók, antiretrovirális szerek, antikoagulánsok és bármely más - terápiás monitorozása, függetlenül a gyártó készleteinek elérhetőségétől. Nem kell drága készleteket vásárolni minden egyes anyaghoz - kifejlesztheti saját módszereit;
• Klinikai toxikológia - több mint 500 narkotikus vegyület és metabolitjainak elemzése egy elemzésben, megerősítő elemzés nélkül
  proteomika és metabolomika.

Ezenkívül a HPLC-MSMS-t vizelet oligoszacharidok, szulfatidok, hosszú szénláncú zsírsavak, hosszú szénláncú epesavak, metilmalonsav, porfiriák vizsgálatára, purin- és pirimidin-anyagcsere-zavarban szenvedő betegek szűrésére használják.

Folyadékkromatográfia alkalmazási példái
tandem tömegspektrometriával kombinálva a klinikai vizsgálatokban.

Újszülött szűrés: A HPLC-MS/MS tömeges alkalmazásának első példája a klinikai diagnosztikában az újszülöttek veleszületett anyagcsere-hibáinak szűrése volt. A fejlett országokban ma már rutinszerű, és több mint 30 különböző betegséget fed le, beleértve az aémiákat, aminoacidopátiákat és a zsírsav-oxidáció hibáit. Külön kiemelendő a születési rendellenességekkel kapcsolatos kutatás, amely súlyos problémákhoz vezethet, ha nem kezelik azonnal (pl. szív- vagy májnagyobbodás, agyödéma). Az újszülöttkori szűrésre a HPLC-MS/MS használatának előnye, hogy egyidejűleg elemezhető minden aminosav és acilkarnitin egy gyors, olcsó és rendkívül specifikus módszerrel.

Terápiás gyógyszerellenőrzés: Az immunszuppresszáns szirolimusz (rapamycin) kifejlesztése és bevezetése a szervátültetés utáni kilökődés megelőzésére a HPLC-MS/MS klinikai laboratóriumokba való bevezetésének egyik fő hajtóereje volt. A modern HPLC-MS/MS módszer lehetővé teszi a takrolimusz, szirolimusz, ciklosporin, everolimusz és mikofenoinsav egyidejű meghatározását.

A HPLC-MS/MS-t citotoxikus, antiretrovirális gyógyszerek, triciklusos antidepresszánsok, görcsoldók és egyéb egyedi adagolást igénylő gyógyszerek elemzésére is használják.

A HPLC-MSMS módszer lehetővé teszi a warfarin R- és S-enantiomereinek elkülönítését és mennyiségi meghatározását 0,1-500 ng/ml koncentráció tartományban.

Gyógyszerek és fájdalomcsillapítók: A HPLC-MS/MS-t széles körben használják ezen vegyületek elemzésére a könnyű minta-előkészítés és a rövid elemzési idő miatt. A módszert jelenleg klinikai laboratóriumokban alkalmazzák a gyógyszerek széles körének jelenlétének szűrésére. A módszer egyedülálló specificitása és érzékenysége lehetővé teszi több mint 500 különböző osztályba tartozó vegyület egyidejű elemzését egy mintában minimális minta-előkészítés mellett. Tehát vizelet analízis esetén elegendő a minta egyszerű 50-100-szoros hígítása. A haj elemzésekor egy csomó 100-200 hajszál helyett egyetlen hajszál is elegendő a droghasználat tényeinek megbízható azonosításához.

Endokrinológia és szteroid analízis: A HPLC-MS/MS-t széles körben használják számos endokrinológiai laboratóriumban szteroidok – tesztoszteron, kortizol, aldeszteron, progeszteron, ösztriol és sok más – elemzésére.

Egyre több laboratórium kezdi alkalmazni a HPLC-MS/MS-t a D3- és D2-vitamin vérszintjének meghatározására.

I. A szteroidok meghatározása (szteroid profil).

A kórházakban és klinikákban működő laboratóriumok ma már több szteroid egyidejű meghatározását is elvégezhetik HPLC/MS/MS segítségével. Nincs szükség nagy mintatérfogatra, ami különösen fontos a gyermekek mintáinak elemzésekor.

Olyan esetek, amikor több (profilozó) szteroid meghatározását célszerű elvégezni:
• A congenitalis adrenalis hyperplasia (CAH) a szteroid bioszintézis veleszületett rendellenessége. Ez a betegségek egy örökletes csoportja, amelyet a mellékvesekéreg enzimek nem megfelelő működése okoz, ami a kortizol termelésének csökkenéséhez vezet. A SAN megbízható diagnózisához ajánlott a kortizol, az androszténdion és a 17-hidroxi-progeszteron meghatározása. A HPLC/MS/MS lehetővé teszi mindhárom szteroid pontos mennyiségi meghatározását egyetlen elemzésben, 100%-os biztonsággal.
• A rutin újszülöttkori immunassay-szűrést az emlőpozitív és hamis negatív eredmények magas aránya jellemzi. A HPLC/MS/MS nem csak a kortizol, hanem az aldoszteron és a 11-dezoxikortizol meghatározása is lehetővé teszi az elsődleges és másodlagos mellékvese-elégtelenség megkülönböztetését.
• A HPLC/MS/MS lehetővé teszi a szteroidok meghatározását prosztatagyulladás és krónikus kismedencei fájdalom szindróma esetén.
• A HPLC-MS/MS lehetővé teszi a szteroid profil meghatározását és a mellékvese korai pubertás okainak azonosítását kisgyermekeknél. Azt találták, hogy ezekben a gyermekekben a tesztoszteron, androszténdion, dehidroepiandroszteron (DHEA) és szulfátjának koncentrációja valamivel magasabb volt, mint az idősebb kontroll gyermekekben.
• Az aktív dohányzók, passzív dohányosok és nemdohányzók szérumát 15 szteroid hormon és pajzsmirigyhormon jelenlétére elemezzük, hogy megvizsgáljuk a füstnek kitett betegek és a hormonkoncentráció közötti összefüggést.
• A HPLC/MS/MS-t egyes női szteroid hormonok vizeletben történő profilálására használják.
• HPLC/MS/MS segítségével értékeltük a neuroaktív hormonok koncentrációját a diabéteszes neuropátia megelőzése érdekében.

II. A pajzsmirigyhormonok meghatározása

A pajzsmirigyhormonok meghatározásának rutin módszerei általában radioimmunoassay-n alapulnak, amely költséges, és csak a T3-at és a T4-et észleli, ami korlátozhatja a pajzsmirigyfunkció meghatározásának és teljes szabályozásának képességét.

• Jelenleg HPLC-MSMS segítségével öt pajzsmirigyhormon egyidejű elemzése történik vérszérummintákban, köztük a tiroxin (T4), 3,3',5-trijódtironin (T3), 3,3',5'- (rT3) , 3 ,3'-dijódtironin (3,3'-T2) és 3,5-dijódtironin (3,5-T2) 1-500 ng/ml koncentráció tartományban.
• A HPLC/MS/MS módszert a pajzsmirigyeltávolításon átesett betegek hormonösszetételének elemzésére is használják. A műtét után meghatározzák a tiroxin (T4), a trijódtironin (T3), a szabad T4 és a pajzsmirigy-stimuláló hormon (TSH) szintjét. A HPLC/MS/MS kiváló módszernek bizonyult a TSH és a pajzsmirigyhormon-koncentráció közötti kapcsolat megállapítására.
• A HPLC/MS/MS módszert alkalmaztuk a tiroxin (T4) meghatározására nyálban és emberi vérszérumban. A módszert nagy reprodukálhatóság, pontosság és 25 pg/ml-es kimutatási határ jellemzi. Tanulmányok kimutatták, hogy diagnosztikus kapcsolat van a nyál T4-koncentrációjában az euthyroid betegek és a Graves-kórban szenvedő betegek között.

A HPLC/MS/MS módszer immár rendelkezik azzal az érzékenységgel, specifitással és pontossággal, amely a biológiai folyadékokban lévő összes szteroid megbízható kimutatásához szükséges, és így növeli a diagnosztikai képességeket, különösen a szteroid tömbök esetében.

III. A 25-hidroxi-D-vitamin meghatározása HPLC/MS/MS módszerrel

A 25-hidroxi-D-vitamin (25OD) a D-vitamin fő keringő formája és aktív formájának előfutára. (1,25-dioxi-D-vitamin). Hosszú felezési ideje miatt a 25OD meghatározása fontos a D-vitamin státuszának meghatározásához a páciens szervezetében. A D-vitamin két formában létezik: D3-vitamin (kolekalciferol) és D2-vitamin (ergokalciferol). Mindkét forma a megfelelő 25OD formákra metabolizálódik. A diagnózis szempontjából nagy jelentősége van annak, hogy olyan analitikai módszerek állnak rendelkezésre, amelyek a vitamin mindkét formáját nagy pontossággal meghatározzák, és lehetővé teszik a D-vitamin-betegségben szenvedő betegek monitorozását, az eddig alkalmazott módszerek nem tették lehetővé a D2- és D3-vitamin külön-külön történő meghatározását. Ráadásul a D2-vitamin magas koncentrációinál a D3 kimutatható mennyiségét alulbecsülik. További hátránya a radioaktív izotópok használata. A HPLC/MS/MS módszer alkalmazása nemcsak a radioaktív izotópok használatának elkerülését tette lehetővé, hanem a vitamin mindkét aktív formájának elkülönített meghatározását is.

A módszer a következő betegeknél alkalmazható:
1. Ha gyanítja, hogy alacsony a D-vitamin tartalma a szervezetben;
2. Ha megmagyarázhatatlan mérgező hatás gyanúja merül fel;
3. A kezelés alatt álló betegek alacsony D-vitamin-tartalmának vizsgálatakor;
4. A HPLC/MS/MS használata lehetővé tette mindkét forma külön-külön történő meghatározását a páciens monitorozása során.

IV. Az immunszuppresszánsok meghatározása HPLC/MS/MS módszerrel

Szervátültetés után az immunszuppresszánsokat egész életen át kell szedni a kilökődés elkerülése érdekében. A nagyon szűk terápiás ablakkal és nagy toxicitással rendelkező immunszuppresszánsok egyedi adagolást igényelnek a maximális hatás eléréséhez. Ezért létfontosságú a fő immunszuppresszánsok – a ciklosporin A, a takrolimusz, a szirolimusz és az everolimusz – monitorozása, hogy a gyógyszerek adagját minden egyes beteg esetében a vérben lévő gyógyszerkoncentrációtól függően módosítsák.

Ezeknek a gyógyszereknek a monitorozására továbbra is alkalmaznak immunológiai vizsgálatokat, de ezek a módszerek drágák, specifitásuk, pontosságuk és reprodukálhatóságuk korlátozott. Az immunológiai módszerekkel kapott eredmények alapján betegek haltak meg az immunszuppresszív gyógyszerek helytelen adagolása miatt. Jelenleg a klinikai laboratóriumokban az immunológiai vizsgálatokat HPLC/MS/MS váltja fel. Például a Müncheni Egyetem klinikáján naponta körülbelül 70 mintát vizsgálnak meg a szirolimusz és a ciklosporin A tartalmára HPLC/MS/MS rendszerrel. Az összes minta-előkészítést és a műszerellenőrzést egy személy végzi. A laboratórium is átáll a takrolimusz ezzel a módszerrel történő elemzésére.

• Leírják a HPLC/MS/MS használatát a takrolimusz, szirolimusz, aszkomicin, demetoxiszirolimusz, ciklosporin A és ciklosporin G rutin egyidejű meghatározására a vérben. A koncentráció által meghatározott tartomány 1,0-80,0 ng/ml. Ciklosporin esetén 25-2000 ng / ml. Az év során több mint 50 000 mintát elemeztek a laboratóriumban.
• Mivel kiderült, hogy a takrolimusz és a szirolimusz egyidejű alkalmazása pozitív terápiás hatást fejt ki, egy egyszerű és hatékony HPLC/MS/MS módszert fejlesztettek ki ezek elkülönítésére a vérből a klinikai vizsgálatokhoz. Egy minta elemzése 2,5 percet vesz igénybe, a takrolimusz esetében 2,46% - 7,04%, a szirolimusz esetében pedig 5,22% - 8,30% pontossággal a teljes analitikai görbét tekintve. A takrolimusz kimutatásának alsó határa 0,52 ng/ml, a szirolimuszé 0,47 ng/ml.

V. A homocisztein meghatározása HPLC/MS/MS módszerrel

A homocisztein szív- és érrendszeri betegségekben (tromboembólia, szívbetegség, érelmeszesedés) és egyéb klinikai állapotokban (depresszió, Alzheimer-kór, csontritkulás, terhességi szövődmények stb.) érdekes. A homocisztein elemzésére szolgáló meglévő módszerek, beleértve az immunvizsgálatot is, drágák. Egy gyors HPLC/MS/MS módszert fejlesztettek ki a homocisztein analízisére, rutin klinikai felhasználásra, nagyszámú minta elemzésére. Az ionizációt elektrospray módszerrel végeztük. A módszer reprodukálható, rendkívül specifikus és pontos. A módszer előnye a reagensek alacsony költsége és a minta-előkészítés egyszerűsége is. Lehetőség van napi 500 vagy több minta elemzésére.

Következtetés

Meg kell jegyezni, hogy annak ellenére, hogy jelenleg jelentősen javított immunológiai vizsgálati módszereket használnak, alapvető technikai korlátok miatt ez a módszer soha nem lesz összehasonlítható pontossággal és specifitással a célanyaghoz képest a HPLC-MSMS-hez képest, különösen metabolitok jelenlétében. Ez nemcsak az ELISA-módszer alacsony pontosságához és a hamis pozitív és álnegatív eredmények magas százalékához vezet, hanem nem teszi lehetővé a különböző klinikai osztályokon az ELISA módszerrel kapott eredmények összehasonlítását. A HPLC-MS/MS alkalmazása kiküszöböli ezt a hátrányt, lehetővé téve nagyszámú minta rendkívül specifikus, pontos és gyors elemzését, nagy megbízhatósággal metabolitok jelenlétében, valamint a plazmában és vérben lévő egyidejű és endogén anyagok által okozott interferencia nélkül. betegek.

A műszerkomplexum látszólag magas költsége ellenére, amint azt a világgyakorlat mutatja, megfelelő működés mellett ez a komplexum 1-2 év alatt megtérül. Ennek oka elsősorban egy elemzés alacsony költsége a több tíz és több száz vegyület egyidejű elemzése miatt, valamint a drága diagnosztikai készletek beszerzésének hiánya. Ezenkívül a laboratóriumnak lehetősége van önállóan kidolgozni a szükséges elemzési módszereket, és nem függ a készletek gyártójától.

A megfelelő műszerkonfiguráció kiválasztása

A tömegspektrometriának számos különféle módszere és tömegspektrométer-típusa létezik, amelyeket számos probléma megoldására terveztek – a több százezer dalton tömegű összetett fehérje-makromolekulák szerkezeti azonosításától kezdve a kis molekulák rutin nagy áteresztőképességű kvantitatív elemzéséig.

A feladat sikeres megoldásához az egyik fő feltétel a megfelelő típusú felszerelés kiválasztása. Nincs olyan univerzális eszköz, amely az analitikai problémák teljes körét meg tudná oldani. Így a mikroorganizmusok azonosításának problémájának megoldására tervezett eszköz nem képes kis molekulák mennyiségi elemzésére. És fordítva. Az a helyzet, hogy a közönséges elnevezés ellenére teljesen más eszközökről van szó, amelyek más-más fizikai elven működnek. Az első esetben ez egy repülési idő tömegspektrométer lézer-ionizációs forrással - MALDI-TOF, a második esetben - háromszoros kvadrupólus elektropermet ionizációval - HPLC-MSMS.

A második legfontosabb paraméter a megfelelő rendszerkonfiguráció kiválasztása. Számos nagy tömegspektrometriás berendezés gyártó létezik. Az egyes gyártók készülékeinek nemcsak erősségei, de gyengeségei is vannak, amelyekről általában inkább hallgatnak. Minden gyártó saját termékcsaládot gyárt. Egy analitikai komplexum költsége 100 000 és 1 000 000 dollár közötti vagy több. A legjobb gyártó és a megfelelő berendezés-konfiguráció kiválasztása nemcsak jelentős pénzügyi forrásokat takarít meg, hanem hatékonyabban is megoldja a problémát. Sajnos számos példa van arra, hogy a laboratórium felszerelését ezen tényezők figyelembevétele nélkül végezték el. Az eredmény tétlen berendezések, kidobott pénz.

A laboratórium sikeres működését meghatározó harmadik tényező a személyzet. A tömegspektrométerekhez magasan képzett személyzetre van szükség. Sajnos egyik oroszországi egyetemen sincs korszerű gyakorlati tömegspektrometria tanfolyam, különösen a klinikai alkalmazások kapcsán, és az egyes laboratóriumok személyzetének képzési feladatait önállóan kell megoldani. Természetesen a gyártó által a berendezés piacra dobását követő 2-3 napos bevezető oktatás egyáltalán nem elegendő a módszer alapjainak megértéséhez és az eszközzel való munkavégzés készségeinek elsajátításához.

A negyedik tényező a kész elemzési módszerek hiánya. Minden laboratóriumnak megvannak a maga kiemelt feladatai, amelyek megoldására saját módszereket kell kidolgozni. Ezt olyan személy teheti meg, aki legalább 2-3 éves tapasztalattal rendelkezik a készüléken. A gyártók esetenként egy-két általános ajánlási módszert kínálnak, de nem igazítják azokat konkrét laboratóriumi feladatokhoz.

BAN BEN BioPharmExpert LLC Több éves tapasztalattal rendelkező szakemberek dolgoznak itt különböző típusú tömegspektrométereken, valamint módszerek fejlesztésén és nagy teljesítményű elemzések megfogalmazásán. Ezért a következő szolgáltatásokat nyújtjuk:

1. Az optimális műszerkonfiguráció kiválasztása konkrét ügyfélfeladatokhoz.
2. Berendezések beszerzése, szállítása és piacra dobása vezető tandem tömegspektrométer gyártóktól A személyzet fokozatos képzése a berendezés forgalomba hozatalától számított egy éven belül.
3. Kész módszerek és adatbázisok összessége alapvető klinikai problémák megoldására.
4. Elemzési módszerek kidolgozása és az ügyfél konkrét feladatainak megoldása a laboratóriumában munkatársai bevonásával.
5. Módszertani támogatás a munka minden szakaszában.

A nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC) egy oszlopkromatográfiás módszer, amelyben a mozgófázis (MP) egy állófázissal (szorbenssel) töltött kromatográfiás oszlopon áthaladó folyadék. A HPLC oszlopokat nagy hidraulikus nyomás jellemzi az oszlop bemeneténél, ezért a HPLC-t néha "nagynyomású folyadékkromatográfiának" is nevezik.

Az anyagok elválasztásának mechanizmusától függően a HPLC következő változatait különböztetjük meg: adszorpció, eloszlás, ioncsere, kizárás, királis stb.

Az adszorpciós kromatográfiában az anyagok szétválása annak köszönhető, hogy eltérő adszorbeáló- és deszorbeálóképességük van egy fejlett felületű adszorbens, például szilikagél felületéről.

A megoszlásos HPLC-ben az elválasztás az elválasztandó anyagok eloszlási együtthatóinak különbsége miatt következik be az álló (általában kémiailag egy álló hordozó felületére ojtott) és a mozgó fázis között.

Polaritás szerint a PF és NF HPLC normál fázisra és fordított fázisra van felosztva.

A normál fázisú kromatográfia a kromatográfia egy olyan változata, amely poláris szorbenst (például szilikagélt vagy szilikagélt ojtott NH 2 - vagy CN csoportokkal) és nem poláris PF-et (például hexánt különféle adalékokkal) használ. A fordított fázisú kromatográfiában apoláros, kémiailag módosított szorbenseket (pl. nem poláris 18 szénatomos alkilcsoport) és poláris mozgófázisokat (pl. metanol, acetonitril) használnak.

Az ioncserélő kromatográfiában a keverék anyagainak oldatban kationokká és anionokká disszociált molekulái a szorbensen (kationcserélőn vagy anioncserélőn) való áthaladáskor szétválnak a szorbens ioncsoportjaival való eltérő kicserélődési sebességük miatt. .

A méretkizárásos (szita, gélen áthatoló, gélszűrős) kromatográfiában az anyagok molekuláit méret szerint különítik el, mivel eltérő behatolási képességük van az állófázis pórusaiba. Ebben az esetben a legnagyobb molekulák (legnagyobb molekulatömegű), amelyek képesek az állófázis minimális számú pórusaiba behatolni, először hagyják el az oszlopot, és a kis molekulaméretű anyagok hagyják el utoljára.

az elválasztás gyakran nem egy, hanem több mechanizmus révén megy végbe egyidejűleg.

A HPLC módszer bármely nem gáz halmazállapotú analit minőségellenőrzésére használható. Az elemzéshez megfelelő eszközöket - folyadékkromatográfokat - használnak.

A folyadékkromatográf összetétele általában a következő fő összetevőket tartalmazza:

– egy PF-előkészítő egység, amely magában foglal egy tartályt mozgófázissal (vagy a mozgófázis részét képező egyedi oldószereket tartalmazó tartályokat) és egy PF gáztalanító rendszert;

– szivattyúrendszer;

– mobilfázisú keverő (ha szükséges);

– mintainjektáló rendszer (injektor);

– kromatográfiás oszlop (termosztátba szerelhető);

– detektor;

– adatgyűjtő és -feldolgozó rendszer.

Szivattyúrendszer

A szivattyúk adott állandó sebességgel szállítják a PF-et az oszlopba. A mozgófázis összetétele állandó vagy változhat az elemzés során. Az első esetben a folyamatot izokratikusnak, a másodikban pedig gradiensnek nevezik. Néha 0,45 µm pórusátmérőjű szűrőket szerelnek be a szivattyúrendszer elé a mozgófázis szűrésére. A modern folyadékkromatográfos szivattyúrendszer egy vagy több számítógéppel vezérelt szivattyúból áll. Ez lehetővé teszi a PF összetételének megváltoztatását egy adott program szerint a gradiens elúció során. A PF komponensek keverése a keverőben történhet alacsony nyomáson (szivattyúk előtt) és nagy nyomáson (szivattyúk után). A keverő használható PF készítésére és izokratikus elúcióra, azonban az izokratikus eljáráshoz a PF komponensek előkeverésével pontosabb komponensarány érhető el. Az analitikai HPLC-szivattyúk lehetővé teszik a PF állandó áramlási sebességét az oszlopba 0,1-10 ml/perc tartományban, akár 50 MPa oszlop bemeneti nyomáson. Célszerű azonban, hogy ez az érték ne haladja meg a 20 MPa-t. A nyomáspulzációkat a szivattyúk kialakításában szereplő speciális csillapítórendszerek minimalizálják. A szivattyúk munkarészei korrózióálló anyagokból készülnek, ami lehetővé teszi agresszív komponensek használatát a PF összetételében.

Kulcsszavak

SZTEROIDOK / LIPIDEK / VÉRSZÉRUM / METABOLIKUS PROFIL / IPARI HULLADÉK/ SZTEROIDOK / ZIPIDEK / VÉRSZÉRUM / METABOLIKUS PROFIL / IPARI HULLADÉKOK

annotáció tudományos cikk az állatorvosi tudományokról, tudományos munka szerzője - Chakhovskiy Pavel Anatoljevics, Jancsevics Alekszej Viktorovics, Dmitrochenko Alesya Egorovna, Ivanchik Alekszandr Viktorovics

Az antropogén tényezők hatása sokrétűen hat az emberi szervezetre és az állatokra. Komplex hatásuk kapcsán az egyes tényezők negatív hatásainak azonosítása meglehetősen nehéz feladat. Az e nehézségek leküzdését lehetővé tevő metabolomikus módszertan segítségével felmértük a hamuzsír-hulladéknak a kísérleti állatok lipidprofiljára gyakorolt ​​hatásának jellegét és mértékét az intranazális oltás során a káliumműtrágyák gyártásából és az ivásból származó hulladékkal. a hamuzsír termelés potenciális zónájában található forrásokból nyert víz. A lipidek szérumból történő izolálása egy speciálisan kifejlesztett szilárd fázisú extrakción alapuló technikával történt, amely lehetővé teszi a koleszterin eltávolítását a mintákból. Minden mintát nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával elemeztünk tömegspektrometriás detektálással (HPLC-MS), majd a kapott kromatogramokat a főkomponensek (PCA) és klaszteranalízis módszerével dolgoztuk fel. A kifejlesztett technika lehetővé teszi a hidrofób metabolitok hatékony elkülönítését a vérszérumban. Megállapították a kísérleti állatok vérszérumának lipidprofilját, különös tekintettel a foszfolipidek és oxiszteroidok tartalmára, valamint eltéréseket találtak a kísérleti és a kontroll állatok anyagcsere-folyamataiban. A kísérleti állatok vérszérumában az oxiszteroidok koncentrációja megemelkedett a kontrollcsoporthoz képest.

Kapcsolódó témák állatorvostudományi tudományos közlemények, a tudományos munkák szerzője - Chakhovskiy Pavel Anatoljevics, Jancsevics Alekszej Viktorovics, Dmitrochenko Alesya Egorovna, Ivanchik Alekszandr Viktorovics

• A patkánymáj hepatocitáinak sejtszervecskéinek válasza az ipari frekvenciájú amplitúdómodulált mágneses tér hatására

  2014 / Belkin Anatolij Dmitrijevics, Michurina Svetlana Viktorovna

• Hormonkészítmények tömegszelektív azonosítása nyers húsban. ß-agonisták elemzése

  2016 / Kulikovsky A.V., Kuznetsova O.A., Ivankin A.N.

• Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia alkalmazása az ubikinon meghatározására vízi szervezetekben

  2003 / Rybin V. G.

• Az N7-etil]-guanin meghatározása patkányok vizeletében a kénes mustárnak való kitettség markereként

  2017 / Orlova Olga Igorevna, Karakasev Georgij Vasziljevics, Shmurak Vladimir Igorevics, Abzianidze Victoria Vladimirovna, Savelyeva Elena Igorevna

• HPLC-MS módszer kidolgozása urzodezoxikólsav analízisére pozitív töltésű ionok kimutatásának módjában

  2013 / Ilya Aleksandrovich Krasnov, D. E. Bobkov, M. Zaiceva, S. S. Prisyach, N. V. Krasnov

• Technológia fejlesztése a fertőző és gyulladásos betegségek expressz diagnosztikájára szolgáló trombodefenzin alapú tesztrendszerek új generációjának létrehozására

  2015 / Ivanov Jurij Boriszovics, Vaszilcsenko Alekszej Szergejevics

• Eljárás a karbamazepin és a karbamazepin-10,11-epoxid egyidejű meghatározására HPLC-MS/MS módszerrel

  2015 / Rodina T.A., Melnikov E.S., Sokolov A.V., Prokofjev A.B., Arkhipov V.V., Adamov G.V., Pozdnyakov D.L., Olefir Yu.V.

• Növényi olajok zsírsavainak és szteroidjainak összetétele

  2006 / Khasanov V. V., Ryzhova G. L., Dychko K. A., Kuryaeva T. T.

• Módszer kidolgozása és validálása a gidazepam biológiai anyagokban történő meghatározására kromatomassza spektrometriával

  2015 / A.V. Chubenko, M.A. Savchenko

• A ciklosporin a meghatározása a vérszérumban terápiás gyógyszermonitorozáshoz

  2008 / Fedorova G. A., Podolskaya E. P., Novikov A. V., Lyutvinsky Ya. I., Krasnov N. V.

A SZÉRUM LIPIDPROFILJÁNAK ELEMZÉSE TENGERMALCÁKBAN A KÖRNYEZETI SZENNYEZŐSÉGEKNEK KITEKINTÉS ALATT AZ ANYAGCSERE VÁLTOZÁSÁNAK KORAI ÉSZLELÉSE

Az antropogén tényezőknek való kitettség sokrétű hatással van az emberek és állatok szervezetére. Az egyes tényezők negatív hatásainak felderítése összetett hatásuk miatt meglehetősen bonyolult feladat. A nehézségek leküzdését lehetővé tevő metabolikus módszertant alkalmazták a káliumműtrágya gyártási hulladékkal történő intranazális beoltás és a forrásból nyert ivóvíz fogyasztása után a káliumműtrágya előállítási hulladéknak a kísérleti állatok lipidprofiljára gyakorolt ​​hatásának jellege és mértéke. a káliumműtrágya-termelés potenciális hatásának zónájában található. A lipidek szérumból történő izolálása egy speciálisan kifejlesztett, a minták szilárd fázisú extrakcióján alapuló technikával történt, amely lehetővé teszi a koleszterin eltávolítását a mintákból. Minden mintát HPLC-MS analízisnek vetettünk alá, majd a kapott kromatogramokat a főkomponens-analízis és a klaszteranalízis módszerével kezeltük. A kifejlesztett technika lehetővé teszi a hidrofób metabolitok hatékony elkülönítését a vérszérumban. Megállapították a kísérleti állatok szérum lipid profilját, különös tekintettel a foszfolipidek és oxiszteroidok tartalmára, valamint eltéréseket találtak a kísérleti és a kontroll állatok metabolikus folyamataiban. Kimutatták, hogy a kísérleti állatok szérumában a hidroxiszteroid koncentrációjának növekedése figyelhető meg a kontrollcsoporthoz képest.

A tudományos munka szövege "WLC-MS módszer tengerimalacok vérszérumának lipidprofiljának elemzésére a környezeti szennyező anyagoknak kitett anyagcsere korai változásainak kimutatására" témában.

[hiéna és higiénia 3/2014

Chakhovskiy P.A.1, Jantsevics A.V.2, Dmitrochenko A.E.2, Ivanchik A.V.2

HPLC-MS-MÓDSZER A VÉRSZÉRUM LIPIDPROFILJÁNAK ELEMZÉSÉRE

tengerimalacok korai anyagcsere-változásainak kimutatására, amikor környezeti szennyező anyagoknak vannak kitéve

TU "Köztársasági Tudományos és Gyakorlati Higiéniai Központ", 220012, Minszk, Belarusz Köztársaság; ^Belarusz Nemzeti Tudományos Akadémia Bioszerves Kémiai Intézete, 220141, Minszk, Fehérorosz Köztársaság

Az antropogén tényezők hatása sokrétűen hat az emberi szervezetre és az állatokra. Komplex hatásuk kapcsán az egyes tényezők negatív hatásainak azonosítása meglehetősen nehéz feladat. Az e nehézségek leküzdését lehetővé tevő metabolomikus módszertan segítségével felmértük a hamuzsír-hulladéknak a kísérleti állatok lipidprofiljára gyakorolt ​​hatásának jellegét és mértékét a káliumműtrágyák gyártásából és az ivásból származó hulladékkal történő intranazális vetés során. a hamuzsír termelés potenciális zónájában található forrásokból nyert víz. A lipidek szérumból történő izolálása egy speciálisan kifejlesztett szilárd fázisú extrakción alapuló technikával történt, amely lehetővé teszi a koleszterin eltávolítását a mintákból. Minden mintát nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával elemeztünk tömegspektrometriás detektálással (HPLC-MS), majd a kapott kromatogramokat a főkomponensek (PCA) és klaszteranalízis módszerével dolgoztuk fel. A kifejlesztett technika lehetővé teszi a hidrofób metabolitok hatékony elkülönítését a vérszérumban. Megállapították a kísérleti állatok vérszérumának lipidprofilját, különös tekintettel a foszfolipidek és oxiszteroidok tartalmára, valamint eltéréseket találtak a kísérleti és a kontroll állatok anyagcsere-folyamataiban. A kísérleti állatok vérszérumában az oxiszteroidok koncentrációja megemelkedett a kontrollcsoporthoz képest.

Kulcsszavak: szteroidok; lipidek; vérszérum; metabolikus profil; ipari hulladék.

P. A. Chakhovskiy1, A. V. Jancsevics2, A. E. Dmitrochenko2, A. V. Ivanchik2 – SZÉRUM LIPIDPROFILOK ELEMZÉSE TENGERMALCÁKBAN A KÖRNYEZETTSÉGNEK KITEKINTÉS ALATT AZ anyagcsere-változás korai kimutatására

1A Köztársasági Tudományos és Gyakorlati Higiéniai Központ, Minszk, Fehérorosz Köztársaság, 220012; 2A Bioszerves Kémiai Intézet, Minszk, Fehérorosz Köztársaság, 220141

Levelezésre: Chakhovskiy Pavel Anatoljevics, [e-mail védett]. com

Az antropogén tényezőknek való kitettség sokrétű hatással van az emberek és állatok szervezetére. Az egyes tényezők negatív hatásainak felderítése összetett hatásuk miatt meglehetősen bonyolult feladat. A nehézségek leküzdését lehetővé tevő metabolikus módszertant alkalmazták a káliumműtrágya előállítási hulladékkal történő intranazális beoltás és a helyi forrásokból nyert ivóvíz fogyasztása után a káliumműtrágya előállítási hulladéknak a kísérleti állatok lipidprofiljaira gyakorolt ​​hatásának jellege és mértéke. a káliumműtrágya-termelés lehetséges hatásának zónájában. A lipidek szérumból történő izolálása egy speciálisan kifejlesztett, a minták szilárd fázisú extrakcióján alapuló technikával történt, amely lehetővé teszi a koleszterin eltávolítását a mintákból. Minden mintát HPLC-MS analízisnek vetettünk alá, majd a kapott kromatogramokat a főkomponens-analízis és a klaszteranalízis módszerével kezeltük. A kifejlesztett technika lehetővé teszi a hidrofób metabolitok hatékony elkülönítését a vérszérumban. Megállapították a kísérleti állatok szérum lipid profilját, különös tekintettel a foszfolipidek és oxiszteroidok tartalmára, valamint eltéréseket találtak a kísérleti és a kontroll állatok metabolikus folyamataiban. Kimutatták, hogy a kísérleti állatok szérumában a hidroxiszteroid koncentrációjának növekedése figyelhető meg a kontrollcsoporthoz képest.

Kulcsszavak: szteroidok, lipidek, vérszérum, anyagcsereprofil, ipari hulladékok.

Bevezetés

A rendszerbiológia és a funkcionális genetika egyik legfontosabb feladata a proteomika, transzkriptomika, valamint a szervezetben zajló anyagcsere-folyamatokra vonatkozó információk integrálása. A szervezetben fellépő bármely betegség vagy kóros folyamat a szövetekben és a vérben lévő kis molekulatömegű metabolitok tartalmában tükröződik. 1971-ben vezették be a "metabolikus profil" kifejezést a vérplazma alacsony molekulatömegű metabolitjainak integrált jellemzésére. Mivel a metabolitok több osztályának egyidejű elemzése rendkívül nehéz és gyakorlatilag irreális, a metabolikus profilok tanulmányozására általában számos módszert alkalmaznak, beleértve a nagy felbontású mágneses magrezonancia (NMR) spektroszkópiát és a kromato-tömeg-spektrometriát.

A metabolomikus vizsgálatok általában a minta-előkészítés során más komponensektől elválasztott anyagok bizonyos csoportjára korlátozódnak. Az így kapott csoportadatok könnyebben értelmezhetők.

Az anyagcsere-profilok (különösen a vizelet és a vérplazma) felhasználhatók a szervezetben mérgező anyagok bevitele által okozott fiziológiai változások természetének meghatározására. A megfigyelt elváltozások sok esetben további jellemzést adhatnak a specifikus elváltozásokról, például a májról és a zsírszövetről.

A vérszérum szteroid- és lipidtartalmának elemzése nagy diagnosztikai potenciállal rendelkezik. A vérszérum lipid összetétele, a szteroid hormonok, prekurzoraik és metabolikus átalakulásuk termékei a szervezet számos funkcionális paraméterét jellemzik. Ezek az anyagok fontos koordináló szerepet töltenek be az anyagcsere és a szív- és érrendszer működésének szabályozásában, valamint részt vesznek a szervezet akut és krónikus stresszre adott válaszában.

A szteroid profil számos nőgyógyászati ​​és onkológiai betegség egyedi diagnosztikai kritériuma, amelyek a szteroid hormonok szintézisének és metabolizmusának zavarával járnak, míg ezek egy része csak a szteroid profil alapján diagnosztizálható. A profilelemzésben nagyon jelentős az a lehetőség, hogy az abszolút értékeket egyszerű változóként használjuk, és összehasonlítsuk a normával. A magnitúdók arányának megváltoztatása azonban fontosabb lehet. Ezenkívül a szteroidprofil egyszerre számos szteroidról nyújt információt.

A vérszérum szteroid profiljának meghatározása hatékony módszer a szteroid anyagcsere szinte minden rendellenességének kimutatására, amely lehetővé teszi

pontos diagnózis számos klinikai helyzetben, például veleszületett mellékvese hiperplázia, I-es típusú hiperaldoszteronizmus, primer hiperaldoszteronizmus, Itsenko-Cushing-kór, mellékvese-elégtelenség stb. , valamint a hipotalamusz hipofízis-mellékvese elégtelensége.

A túlsúlyos kísérleti patkányok szervezetében a káliumműtrágya-hulladék túlnyomó részét képező só túlzott bevitele az aldoszteronszintézis túlzott aktiválódásához vezet, valamint magas vérnyomást és metabolikus szindrómával járó vesekárosodást okoz.

Az ipari termelés magas fokú környezetszennyezettségű régióiban a lakosság előfordulási aránya általában magasabb, mint a viszonylag „tiszta” régiókban. Kutatásunk tárgya Szoligorszk városa volt, amely a káliumércek nagyszabású bányászatának és feldolgozásának övezetében található. A hamuzsírüzemek sólerakói és iszaptározói területén nátrium-klorid szikesedés zóna alakult ki, amely több mint 100 m mélységig borítja a talajvizet, amely hatással lehet az ivóvíz-ellátó források és a légköri levegő szennyezettségére.

Az egyes környezeti összetevők szennyezésének hatásának felmérésére a káliumműtrágyák ipari gyártása területén a vérszérum lipidprofiljait elemeztük, mint a korai anyagcserezavarok indikátorát vegyszerek keverékének hatására.

A munka célja az anyagcsere-változások azonosítása laboratóriumi állatokban a hamuzsír termelési hulladéknak való kitettség és a termelési hulladék által potenciálisan érintett forrásból nyert ivóvíz fogyasztása során nagy teljesítményű folyadékkromatográfia tömegspektrometriás detektálással (HPLC-MS) segítségével.

A vizsgálat tárgya a kísérleti és a kontrollcsoport kísérleti állatok (tengerimalacok) vérszéruma volt.

Anyagok és metódusok

Kísérleti vizsgálatokat 35 tengerimalacon (17 nőstény és 18 hím) végeztek, 305-347 g tömegűek.

[hiéna és higiénia 3/2014

Kísérleti csoport (magvak hamuzsír-műtrágyák ipari előállításából származó hulladékkal és ivóvíz Szoligorszk város vízellátó rendszeréből), 20 egyed (10 nőstény és 10 hím);

Kontroll csoport (alapozás izotóniás nátrium-klorid oldattal az alapozási eljárás okozta stresszfaktor hatásainak kiküszöbölésére), 15 fő (8 hím és 7 nőstény).

A kísérlet során naponta figyelték az állatok általános állapotát, a takarmány- és vízfogyasztást.

A hamuzsírműtrágyák gyártásából származó hulladékok krónikus inhalációs expozíciójának (12 hét) szimulálására, MU. No. 11-11-10-2002 "A toxikológiai és allergológiai vizsgálatok megszervezésének követelményei a levegőben lévő fehérjetartalmú aeroszolok higiénikus szabályozása során munkaterületre", beleértve a vetőmag adagjának meghatározását is. A sólerakókból származó mintákat márványmozsárban homogén poros állapotúra őröltük, desztillált vízben a szükséges koncentrációig feloldottuk a kísérleti állatok testtömegének figyelembevételével (a dózis beállításához hetente ellenőriztük a testsúlyt). A számított dózisok a következők voltak: a kísérlet elején - 2,028 mg / 0,1 cm3, 4 hét után - 2,85 mg / 0,1 cm3, 6 hét után - 3,17 mg / 0,1 cm3, 8 hét után és a kísérlet végéig 3,8 mg/0,1 cm3.

Érzéstelenítés nélküli tengerimalacot emelt fejjel fekvő helyzetben rögzítettünk, az orrlyukakba felváltva (frakcionáltan) (2-3 percen belül) adag meleg oldatot fecskendezünk pipettaadagolóval oly módon, hogy a tüsszögést kizárjuk. . A keletkező "csikorgó" hangok megerősítették, hogy az oldat behatolt a légutakba.

Az állatok kísérleti csoportja 12 héten keresztül naponta egyszer, heti 5 napon "belélegezte" a keveréket. A kontrollcsoport állatai fiziológiás sóoldatot (0,9% NaCl) "inhaláltak".

A biológiai anyag kiválasztásához az állatokat elaltattuk (éteres érzéstelenítés), majd lefejezés után vért vettünk. A szérumot 3000 rpm-en 15 percig végzett centrifugálással nyertük, és -20 C-on tároltuk további vizsgálatokhoz. A vérszérumban a foszfolipideket, oxiszteroidokat és zsírsavakat elemezték.

Minta előkészítés. Egy belső standardot, a progeszteront adtuk a vérszérumhoz a 10-5 M koncentráció eléréséig (10 μl/1 ml minta). Ezután a mintában lévő fehérjék kicsapásához és a szteroidok extrahálásához metanolt adtunk hozzá 70%-os végső koncentrációig (2,33 ml metanol 1 ml mintánként), majd 15 percig 10 000 g-vel centrifugáltuk. A mintában lévő fehérjék sűrű csapadékot képeztek. A felülúszót elválasztottuk a pellettől, és 100 mg oktadecilszilil-szilikagélt tartalmazó, előre kondicionált szilárd fázisú extrakciós (SPE) oszlopon engedtük át. Az SFE oszlopot úgy kondicionáltuk, hogy egymás után 2 ml metanolt, 2 ml vizet és 2 ml 70%-os metanolt engedünk át. Az első szakaszban a koleszterin kötődik az oszlophoz, amelynek tartalma a vérplazmában és más biológiai folyadékokban meglehetősen magas, valamint számos más erősen hidrofób lipid. A koleszterin megkötése után az oszlopot tovább mostuk 2 ml 70%-os metanollal. Ha a mintában magas a koleszterintartalom vagy a minta nagy térfogata, használja

magas szorbens tartalmú TFE oszlopot használtak. Az eluátumokat egyesítjük és bepároljuk. A bepárlást 50 °C-on inert gázsugárban hajtjuk végre. A száraz maradékot 500 µl metanolban oldjuk, és 10 percig 10 000 g-vel centrifugáljuk. Ebben az esetben poláris, metanolban oldhatatlan vegyületek váltak ki. A felülúszót elválasztottuk a csapadéktól, és vízzel 10%-os metanol-koncentrációig hígítottuk. A kapott oldatot előre kondicionált TFE oszlopon engedjük át (2 ml metanolt, 2 ml vizet és 2 ml 10 %-os metanolt engedünk át), és 2 ml 10 %-os metanollal mossuk. Az oszlophoz kötött szteroidokat 3 ml 80%-os metanollal eluáltuk. Az oldatot bepároljuk, és a száraz maradékot 100 μl metanolban feloldjuk. A kapott oldatot HPLC-MS alkalmazásával analizáltuk.

HPLC elemzés. Az analízist LCQ-Fleet tömegspektrometriás detektorral felszerelt Accela kromatográfon végeztük. Az elválasztást Cosmosil 5C18-MS-II oszlopon végeztük 4,6*150 mm geometriai paraméterekkel (Nacalai Tesque, Japán).

Elválasztási program (A oldószer - víz, B oldószer - metanol, áramlási sebesség 500 μl / perc): 5 percig 60% B, 12 percig - lineáris gradiens 60-95% B, 10 percig - 95% B, 8 percig - lineáris gradiens 95-100% B, 5 perc - 100% B, 5 perc - 60% B.

A tömegspektrometriás elemzéshez atmoszférikus nyomású kémiai ionizációs (APCI) forrást használtunk. Ionizációs forrás paraméterei: párologtató hőmérséklet - 350°C, szárítógáz áramlása - 35 egység, segédgáz áramlása - 5 egység, kapilláris hőmérséklet - 275°C, kapilláris feszültség - 18 V, feszültség az ionobjektíven - 80 V. Felhasznált adatok- függő letapogatási mód (Data Dependent™) ioncsapdával az 50-1000 m/z szkennelési tartományban.

A tömegspektrometriás detektorral kémiai ionizációs módban (teljes ionáram) kapott kromatogramokat az Xcalibur csomagból (Thermo Sci, Egyesült Államok) származó Qual Browser program segítségével szöveges formátumba konvertáltuk. A kapott információkat a Statistica 10 csomagban megvalósított főkomponens módszerrel, valamint klaszterelemzési és dendrogramok készítésére szolgáló eszközökkel dolgoztuk fel. A tömegspektrumok értelmezésére és az egyes vegyületek azonosítására egy kézikönyvet használtak.

Eredmények és vita

Az adaptáció kezdeti módszereként a szteroidok szérumból és vérplazmából történő szilárd fázisú extrakciójának módszerét alkalmazták, amelyet a "Macherey-Nagel" cég kézikönyvében ismertetett Szilárd fázisú extrakció. Alkalmazási útmutató, amely az SPE oszlopok használatára vonatkozó ajánlásokat tartalmaz. A szilárd fázisú extrakcióval adaptált minta-előkészítési technika lehetővé tette a foszfolipidek, hidroxi-szteroidok és zsírsavak hatékony izolálását a tengerimalacok vérszérumából.

A leírt kromatográfiás elválasztási technika lehetővé teszi mind a szteroid hormonok, mind a szérumlipidek hatékony elválasztását.

A mintákat a leírt módszerek szerint elemeztük. ábrán 1 (lásd a 2. fedőlapot) példaként, a kísérleti csoportból származó 3 minta elemzéséből nyert egymásra helyezett kromatogramok láthatók (kiemelve

Rizs. 4. ábra: 21,5 perces retenciós idővel rendelkező anyag tömegspektrumai: a - kémiai ionizáció atmoszférikus nyomáson negatív módban; b - kémiai ionizáció atmoszférikus nyomáson pozitív módban.

pirossal) és 3 minta a kontrollcsoportból (kék színnel kiemelve). Hasonló mintát figyeltek meg más esetekben is.

Ezen adattömbök feldolgozásához a főkomponens módszert (PCA) és a klaszteranalízist alkalmaztuk, amely lehetővé tette a lipidprofilok különbségeinek azonosítását a kontroll és a kísérleti csoportok között. A kapott 1. és 2. főkomponens PCA-diagramja

ábrán látható, ha az adatdimenzió csökken. 2 (lásd a 2. borítólapot). A grafikonon jól látható, hogy a pontok 2 csoportba vannak egyesítve, amelyek az 1., 4., illetve 2., 3. negyedben helyezkednek el. Ebben az esetben a kísérleti mintáknak megfelelő pontok elsősorban az 1. és 4. kvadránsba esnek, a kontroll mintáknak megfelelő pontok a 2. és 3. kvadránsban lokalizálódnak. Az azzal kapott dendrogram

[hiéna és higiénia 3/2014

A kromatogramon jelenlévő csúcsok azonosítása

Retenciós idő, min Főcsúcsok "+" üzemmódban Főcsúcsok "-" üzemmódban

19,15 393,7 446,8

448,7 493,5 623,4 524,4

19,35 87 227 271 335,5 353,3 371,2 389.1 448.2 493.3 405,4

21,50 316,1 390,0

430.3 448.4 779,1

23,8 319.4 391,6 429.5 783,2

24,35 414,8 448,8

31,73 313,3 330,9

33,9 231.5 245.5 263,3 281,1 295.1 305.2 371.3 521.0 663.1 279,4

Anyag

Foszfatidilkolin

Arachinsav

Foszfátsav 42:4

Arachic és dokozát-traénsav

Dokozapentaén

Linolsav

Dihidroxikoleszterin

A stern elemzést az ábra mutatja. 3. A kromatográfiás adatok statisztikai elemzése tehát a kontroll és a kísérleti csoportba tartozó kísérleti állatok szervezetében lezajló anyagcsere-folyamatok eltéréseit mutatja.

A specifikus metabolikus változások azonosításához tömegspektrumokat fejtettünk meg és azonosítottunk

az egyes vegyületeket idézzük (lásd a táblázatot). Az elemzéshez nem elegendő mintatérfogat nem tette lehetővé a szérum szteroid hormonjainak profiljában bekövetkezett változások kimutatását. A kromatogramon azonban közepes polaritású lipideket mutattunk ki.

Az egyes vegyületeket a különböző ionizációs módok között rögzített anyagok tömegspektrumának elemzésével azonosították. Így egy anyag tömegspektruma két ionizációs módban, 21,5 perces retenciós idővel az ábrán látható. 4. A spektrum elemzése azt mutatta, hogy az anyag 780 molekulatömegű diacil-sn-glicerofoszfát (R1(311) = 20:0 zsírsav (arachid), R2(331) = 22:4 zsírsav (dokozatetraén) ).

Azt találták, hogy a 42,52 perces retenciós idejű kromatográfiás csúcs a dihidroxikoleszterinnek felel meg, amely feltehetően az epesavak bioszintézisének egyik prekurzora. A vérszérum oxiszteroid-tartalmának különbségei az epesavak metabolizmusának lehetséges megsértését jelzik. Látható, hogy az ábrán látható kromatogramok. 1, a kísérleti állatok vérszérumában a kontrollhoz képest megnövekedett oxiszteroid koncentráció (csúcsok 35-45 perces retenciós idővel).

következtetés. A munkában alkalmazott technika nagy hatékonysággal teszi lehetővé a környezetszennyező anyagok hatására kialakuló korai lipidanyagcsere zavarok kimutatását. A kapott eredmények azt mutatják, hogy a sólerakók vizes oldatának intranazális beadása a Cavia porcellus kísérleti állatoknak a lipidek és oxiszteroidok metabolizmusának megváltozásához vezet. Különösen az epesav-prekurzorok (hidroxiszteroidok) állatokban megfigyelt megnövekedett tartalma összefüggésbe hozható a májműködés károsodásával és az epesavak bioszintézisében részt vevő enzimekkel. Így a leírt megközelítés felhasználható a lipidanyagcsere-zavarok kimutatására a technogén szennyezettségű régiók lakóiban.

Irodalom

1. Horning E.C., Horning M.G. Metabolikus profilok: gázfázisú módszerek a metabolitok elemzésére. Clin. Chem. 1971; 17(8): 802-9.

2. Constantinou M.A., Tsantili-Kakoulidou A., Andreadou I., Iliodro-mitis E.K., Kremastinos D.T., Mikros E. Application of NMR-based metabonomics in the study of myocardialis ischaemia-reperfusion, ischaemiás prekondicionálás és antioxidáns beavatkozás nyúlban. Eur. J Pharm. sci. 2007; 30. (3-4): 303-14.

3. Lu W., Bennett B.D., Rabinowitz J.D. Analitikai stratégiák LC-MS-alapú célzott metabolomikákhoz. J Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. élet sci. 2008; 871(2): 236-42.

4. Novotny M.V, Soini H.A., Mechref Y. A kromatográfiás, elektroforetikus és tömegspektrometriás profilokban tükröződő bioindividualchemicality. J Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. élet sci. 2008; 866 (1-2): 26-47.

5. Német J.B., Gillies L.A., Smilowitz J.T., Zivkovic A.M., Watkins S.M. Lipidomika és lipidprofilozás a metabolomikában. Curr. Opin. Lipidol. 2007; 18(1): 66-71.

6. Schwarz E., Liu A., Randall H., Haslip C., Keune F., Murray M. et al. A szteroid profilalkotás UPLC-MS/MS segítségével második szintű tesztként a veleszületett mellékvese-hiperplázia újszülöttek szűrésében: Utah tapasztalatai. Pediatr. Res. 2009; 66 (2): 230-5.

7. Rauh M. Szteroidmérés LC-MS/MS-sel. Alkalmazás

Az Art. Chakhovsky et al.

Rizs. 3. Klaszteranalízis alapján felépített dendrogram, amely a minták csoportonkénti klaszterezését szemlélteti.

Az Art. Chakhovsky et al.

Rizs. 1. A kontrollcsoport 1-3. mintájának (pirossal kiemelve) és a kísérleti csoport 15-17. mintájának (kék színnel kiemelve) átfedő kromatogramja.

Az esetek vetülete a faktorsíkra (1 x 2) Esetek, ahol a koszinusz négyzet összege >= 0,00

18/3 9/z 21/1 ■ O

1 kölcsön "Sh körülbelül 28/1" 22/10 41 /1 p

1. faktor: 65,71%

Rizs. 2. A kromatogramok PCA-val történő feldolgozásával kapott grafikon. A kontrollcsoport kékkel, a kísérleti csoport pirossal van kiemelve.

1

Validált HPLC-MS/MS módszert fejlesztettek ki az 1,3,4-tiadiazol LHT7-09 új aminosavszármazékának azonosítására és mennyiségi meghatározására. Az LHT7-09 tömegspektrometriás detektálás maximális érzékenységét pozitív ion detektálási módban érték el 5500 V elektrospray feszültség és 36 V deklaszterezési potenciál mellett. Az azonosított MRM átmenetek megerősítették az új aminosav származék kémiai szerkezetét 1, 3,4-tiadiazol. Az LHT7-09 hatékony izolálására a tiadiazolil-amidok többkomponensű keverékeiből a nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás gradiens módot fejlesztették ki, acetonitril és ionmentesített víz különböző arányú keverékét használva eluensként. Ilyen kromatográfiás körülmények között az LHT7-09 vegyület retenciós idejét 11 percben határoztuk meg. Az LHT7-09 vegyület mennyiségi meghatározásához kalibrációs oldatot fejlesztettek ki a kromatográfiás csúcs területének az oldat koncentrációjától való függésére.

whr-ms/ms

kromatográfia

tömegspektrometria

tiadiazol

1. Kazaishvili Yu.G., Popov N.S. Új tiadiazol-származékok gyulladáscsökkentő hatásának vizsgálata patkányok formalin mancsödémájában / Yu.G. Kazaishvili, N.S. Popov // A tudomány és az oktatás modern problémái. - 2013. - 3. sz. www..

2. Új gombaellenes hatású tiadiazol származékok / A.S. Koshevenko [et al.] // Advances in Medical Mycology. - 2015. - T. 14. - S. 348-351.

3. Új furil-2-szubsztituált 1,3,4-tiadiazolok, 1,2,4-triazolok szintézise és daganatellenes hatása / T.R. Ovsepyan [et al.] // Chemical Pharmaceutical Journal. - 2011. - T. 45. - 12. sz. - P. 3-7.

4. Popov N.S., Demidova M.A. A tiadiazol új aminosav-származéka akut toxicitásának értékelése intraperitoneálisan egereknek adagolva / N.S. Popov, M.A. Demidov // Felső-Volga Orvosi Lapja. - 2016. - V. 15. sz. 1. - S. 9-12.

5. Popov N.S., Demidova M.A. A tiadiazol új aminosav-származékának ulcerogenitásának értékelése patkányoknak intragasztrikusan beadva / N.S. Popov, M.A. Demidova // Doktori végzettségű hallgató. - 2017. - 1. szám (80). - S. 71-78.

6. 2-amino-5-alkil(aril-alkil)-1,3,4-tiadiazolokon alapuló fenil-tio- és benzil-szulfonil-ecetsav-amidok szintézise és antimikrobiális aktivitása / S.A. Serkov [et al.] // Chemical Pharmaceutical Journal. - 2014. - T. 48., 1. sz. - S. 24-25.

7. Arpit K., Basavaraj M., Sarala P., Sujeet K., Satyaprakash K. Imidazotiadiazol származékok szintézise és farmakológiai aktivitása // Acta Poloniae Pharmaceutica, Drug Research. 2016. évf. 73. Nem. 4. P. 937-947.

8. Eman M. Flefel, Wael A. El-Sayed, Ashraf M. Mohamed Synthesis and Cancer Activity of New 1-Thia-4-azaspirodecane, Their Derived Thiazolopirimidin and 1,3,4-Thiadiazole Thioglycosides // Molecules. 2017. sz. 22. (1) bekezdése alapján. 170. o.

9. Jorge R.A. Diaz, Gerardo Enrique Cami. Az 5-amino-2-szulfonamid-1,3,4-tiadiazol sói, amely az acetazolamid szerkezeti és analógja, érdekes karboanhidráz-gátló tulajdonságokat, vizelethajtót és görcsoldó hatást mutatnak // Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 2016. évf. 12. Nem. 6. P. 1102-1110.

10. Naiyuan Chen, Wengui D., Guishan L., Luzhi L. Dehidroabietsav alapú 1,3,4-tiadiazol-tiazolidinon vegyületek szintézise és gombaellenes hatása // Molecular Diversity. 2016. évf. 20. Nem. 4. P. 897-905.

11. Yomna, I. El-Gazzar, Hanan H. Georgey, Shahenda M. El-Messery. A quinazolin-4(3H)-on új (1,2,4-triazol vagy 1,3,4-tiadiazol)-metil-tio-származékainak szintézise, ​​biológiai értékelése és molekuláris modellezése, mint DHFR-gátlók // Bioorganic Chemistry. 2017. évf. 72. P. 282-292.

A nagy teljesítményű folyadékkromatográfia tömegspektrometriás detektálással az egyik legígéretesebb módszer a gyógyszerek azonosítására és mennyiségi meghatározására különféle biológiai objektumokban. A módszert a nagy specifitás, pontosság és az anyagok minimális koncentrációban történő meghatározásának képessége különbözteti meg, ami lehetővé teszi a gyógyszerek kvantitatív meghatározására történő alkalmazását farmakokinetikai vizsgálatokban és gyógyszermonitorozásban, ami a klinikai laboratóriumi diagnosztika szempontjából jelentős. Ennek érdekében szükséges a különböző gyógyászati ​​anyagok mennyiségi meghatározására szolgáló módszerek kidolgozása és validálása, beleértve az innovatívakat is, amelyek a HPLC-MS/MS módszeren alapulnak.

A nem szteroid gyulladáscsökkentők csoportjába tartozó eredeti gyógyszer az acexazolamid, az 1,3,4-tiadiazolamid és az acexámsav új származéka. Ennek a vegyületnek jelentős előnye az alacsony toxicitása és alacsony fekélyessége. A farmakokinetikai vizsgálatok elvégzéséhez és egy adott gyógyászati ​​anyag biológiai hasznosulásának felméréséhez különféle beadási módok esetén szükséges egy megbízható módszer kidolgozása annak biológiai folyadékokban történő mennyiségi meghatározására.

A tanulmány célja módszertan kidolgozása volt a tiadiazol származékok csoportjába tartozó új nem szteroid gyulladáscsökkentő gyógyszer azonosítására és mennyiségi meghatározására HPLC-MS/MS segítségével.

Anyagok és metódusok

A vizsgálat tárgya egy új, LHT 7-09 laboratóriumi kódú tiadiazol származék volt, amelyet a JSC "VNTs BAV" (Staraya Kupavna) prof. S.Ya. Skachilova (1. ábra).

2-(5-etil-1,3,4-tiadiazolil)-amid 2-acetil-amino-hexánsav

Rizs. 1. Az LHT 7-09 kémiai szerkezete (bruttó képlet: C 12 H 20N 4 Körülbelül 2S; moláris tömege 284,4g/mol)

A Connection LHT 7-09 megjelenésében fehér por, amely gyakorlatilag vízben oldhatatlan, alkoholban oldódik, acetonitrilben könnyen oldódik.

Validált nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát tömegspektrometriás detektálással (HPLC-MS/MS) használtunk az LCT 7-09 azonosítására és mennyiségi meghatározására.

A kromatográfiát Agilent 1260 Infinity II nagy teljesítményű folyadékkromatográffal (Agilent Technologies, Németország) végeztük. A vizsgálathoz Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 µm 2,1×10 mm analitikai oszlopot használtunk. A vizsgált vegyület izolálásához gradiens kromatográfiás módot fejlesztettünk ki. Eluálószerként acetonitrilt, ionmentes vizet és ammónium-acetátot használtunk különböző arányokban.

A tömegspektrometriát ABSciexQTrap 3200 MD tripla kvadrupólus tömegspektrométeren (ABSciex, Singapore) végeztük elektrospray ionforrással (TurboV TurboIonSpray szondával). A tömegspektrométert 6,1×10-2 mg/l koncentrációjú rezerpin tesztoldattal kalibráltuk.

A vizsgált minták tömegspektrometriás analízisét elektrospray módban, a minta és az eluátum kromatográf által biztosított közvetlen injektálásával végeztük. A vizsgálati minták tömegkromatográfba történő közvetlen befecskendezése 4,61 mm átmérőjű fecskendős pumpával történt, 10 μl/perc sebességgel.

Egy új tiadiazol-származék azonosítására és mennyiségi meghatározására szolgáló technika kidolgozásakor a nagy teljesítményű folyadékkromatográfia és tömegdetektálás optimális feltételeit választották ki. Figyelembe vették az anyag kromatográfiás oszlopból való kilépési idejét és az MRM átmenetet (regisztráció megtörtént m/z prekurzor ion az első analitikai kvadrupólon Q1 és m/z termékionok a második analitikai kvadrupólon Q3). Az LHT 7-09 mennyiségi meghatározásához kalibrációs grafikont állítottunk össze a 0,397 és 397 ng/ml közötti koncentrációtartományban.

Szoftverként az AnalystMD 1.6.2. szoftvert (ABSciex) használtuk.

Eredmények és vita

A kísérleti vizsgálat első szakaszában a vizsgálati minta tömegének kimutatását fecskendős pumpa segítségével a tömegdetektorba történő közvetlen injektálással végeztük. A minta-előkészítés szakaszában acetonitril és ionizált víz 2:1 arányú elegyében LHT 7-09 (500 ng/ml) oldatot kaptunk ammónium-acetát (0,1%) hozzáadásával.

Az előzetes kísérletek azt mutatták, hogy a pozitív ion detektálási módban az LCT 7-09 detektálás érzékenysége nagyobb, a tömegspektrum intenzívebb és informatívabb, mint a negatív ionos detektálási módban. E tekintetben a további vizsgálatok során csak a pozitív ionizációs módot alkalmazták.

Az intenzív csúcs eléréséhez a következő tömegérzékelési feltételeket választottuk: : pozitív polarizáció, 5500,0 V elektrospray feszültség, 36,0 és 6,5 V deklaszterezési potenciál és 6,5 V bemeneti potenciál 20,0 psi függönygáz-nyomásnál és 40,0 psi permetgáznál, 10 µl/perc sebességgel. A szkennelési tartomány 270-300 Da volt.

A kapott tömegspektrum elemzése a Q1 első analitikai kvadrupólusban azt mutatta, hogy ilyen körülmények között egy hidrogén proton hozzáadása következtében a vizsgált vegyület + protonált molekulája keletkezik, melynek értéke m/ z 285,2 Igen (2. ábra).

Rizs. 2. A protonált LHT 7-09 molekula tömegspektruma (pozitív ion pásztázási módban +)

A második Q3 analitikai kvadrupólon a prekurzor ionhoz termékionokat regisztráltunk a következő értékkel: m/z 285,2 Igen. A 2. rendű tömegspektrum elemzése sok csúcs jelenlétét mutatta ki, amelyek közül 3 volt a legintenzívebb. m/z 114,2 Da, m/z 130,2 Da és m/z 75,1 Da (3. ábra).

Rizs. 3. Termékionok tömegspektruma (pozitív ion pásztázó módban, prekurzor ionm/ z285,2 Igen)

A nagy intenzitású ionjel eléréséhez a Q2 ütközési cellában az optimális energiaértékeket választottuk ki (a 0 és 400 V közötti energiatartományt vettük figyelembe). Értékekkel rendelkező termékionokhoz m/ z 114,2 Da, 130,2 Da és 75,1 Da, az optimális energia az ütközőcellában 27 V volt; 23 V és 49 V.

Feltételezzük, hogy a termék ion értékkel m/ z A 114,2 Da az 5-amino-2-etil-1,3,4-tiadiazol töredéke, mivel más 1,3,4-tiadiazol-származékok fragmentációja szintén azonos értékű termékiont tár fel. m/ z. Értékes ion termék m/ z A 130,2 Da valószínűleg az acexámsav protonált töredéke. Így a vizsgált minta tömegdetektálásának eredményei megerősítették az új 1,3,4-tiadiazol származék kémiai szerkezetét.

A kísérleti vizsgálat következő szakaszában az elemzett vegyületet HPLC-tömegspektrometriával elemeztük.

A HPLC-MS/MS módban a következő ionizációs körülményeket alkalmaztuk: elektrospray feszültség 5500,0 V, mozgófázis áramlási sebessége 400 µl/perc, nitrogén hőmérséklet 400°C, függönygáz és permetezési áramlási nyomás 20,0 és 50,0 psi. Az egyedi tömegspektrumok felvételi sebessége 100 spektrum volt másodpercenként. Ahhoz, hogy a kromatogramon összegzett tömegspektrumot kapjunk, 10,5-11,5 perces időintervallumot jelöltünk ki; a termékionok jelének intenzitása szerint ábrázoltuk az ionáram időfüggésének görbéit és a vizsgált vegyületnek megfelelő egyes jelek csúcsainak területét. Az analitikai oszlopba injektált minta térfogata 10 µl volt.

A vizsgált vegyület izolálásához nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás gradiens módot alkalmaztunk, amelyet az eluens összetételének megváltoztatásával biztosítottunk az analitikai oszlop bejáratánál. Eluálószerként acetonitrilt, ionmentes vizet és ammónium-acetátot használtunk különböző arányokban. A kromatográfiás gradiens mód megválasztását az okozta, hogy az izokratikus elúciós mód körülményei között (beleértve az acetonitril különböző koncentrációit is) nem lehetett szimmetrikus alakú tesztanyag-csúcsot elérni. elemzésre alkalmas retenciós idő. A tanulmány szerint a következő eluens-utánpótlási mód volt optimális: 0-4 perc között az acetonitril koncentrációja 1% volt; 4-8 perccel az acetonitril koncentrációjának lineáris növekedése 99%-ig; 8-12 perc - izokratikus metszet (1% acetonitril). A vizsgálat befejezése után a kromatográfiás oszlopot 30%-os acetonitril oldattal mostuk 5 percig.

A leírt kromatográfiás módot alkalmazva a vizsgált vegyületre megfelelő intenzitású szimmetrikus csúcsot kaptunk (4. ábra).

Rizs. 4. LHT 7-09 kromatogram (analitikai oszlopAgilentPoroshell 120 EC-C18 2,7 µm 2,1 x 10 mm; gradiens módú kromatográfia)

A különböző koncentrációjú LHT 7-09 oldatokra kapott kromatogramok elemzése azt mutatta, hogy a retenciós idő (tR) ezen elúciós körülmények között 11 perc volt, és nem függ a vizsgált anyag koncentrációjától. Ebben a tekintetben a retenciós idő értéke további kritériumként használható az LHT 7-09 hitelességének igazolására többkomponensű keverékekben. Figyelemre méltó, hogy ezekkel a kromatográfiás paraméterekkel az LHT 7-09 nem csak tömegdetektorral azonosítható, hanem más detektorokkal is, beleértve a fotometrikusat is.

Az új tiadiazol-származék mennyiségi meghatározásához kalibrációs görbét állítottunk fel a 0,397 ng/mL és 397 ng/mL közötti koncentráció tartományban (5. ábra).

Rizs. 5. ábra: Kalibrációs grafikon az LHT 7-09 koncentrációjának meghatározásához (az abszcissza tengely mentén - az LHT 7-09 koncentrációja ng/ml-ben, az ordináta tengely mentén - a csúcsterület impulzusokban)

A kalibrációs oldat kifejlesztéséhez LHT 7-09 oldatokat használtunk 0,397 koncentrációban; 1,980; 3,970; 19,8; 39,7; 198,0; 397,0 ng/ml. A csúcsterület függését a vizsgált vegyület koncentrációjától a következő regressziós egyenlettel írtuk le:

y= 8,9e 5 x 0,499, a regressziós együttható értéke r=0,9936 volt.

Megjegyzendő, hogy a kifejlesztett kalibrációs megoldás lehetővé teszi a vizsgált vegyület nagy pontosságú mennyiségi meghatározását a koncentrációk széles tartományában, ami lehetővé teszi ennek a módszernek a felhasználását a gyógyhatású anyag minőségének felmérésére, ill. farmakokinetikai vizsgálatokat végezzen.

A vizsgálat eredménye tehát a tiadiazol új aminosavszármazékának HPLC-MS/MS segítségével történő azonosítására és mennyiségi meghatározására szolgáló módszer kidolgozása volt.

következtetéseket

1. A HPLC-MS/MS lehetővé teszi a tiadiazol új aminosav-származékának nagy pontosságú azonosítását és mennyiségi meghatározását.
2. Az új LHT 7-09 tiadiazol származék tömeges kimutatását pozitív ion pásztázó módban (MRM átmeneti - prekurzor ion Q1) kell elvégezni m/ z 285,2 Igen; termékionok Q3 m/ z 114,2 Da, m/ z 130,2 Da és m/ z 75,1 Da).
3. Az LCT 7-09 többkomponensű keverékekből való izolálására nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás technikát fejlesztettek ki (analitikai oszlop Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 μm 2,1 × 10 mm; eluens acetonitril: ioncserélt víz: ammónium-acetát; gradiens mód).

Bibliográfiai hivatkozás

Popov N.S., Malygin A.S., Demidova M.A. HPLC-MS/MS-MÓDSZER FEJLESZTÉSE EGY ÚJ TIADIAZOL SZÁRMAZÉK AZONOSÍTÁSÁRA ÉS MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSÁRA // A tudomány és az oktatás modern problémái. - 2017. - 5. sz.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=26988 (hozzáférés dátuma: 2020.02.01.). Felhívjuk figyelmüket a Természettudományi Akadémia kiadója által kiadott folyóiratokra.