Ферментативный гидролиз крахмала протекает под влиянием ферментов амилаз, которые содержатся в слюне, соке поджелудочной железы, крови, печени, мозге. Источниками амилаз в промышленности служат проросшие зерна злаков (солод) и культуры плесневых грибов.

Известны а- и -амилазы, которые несколько различаются по характеру действия. Под влиянием а-амилазы процесс гидролитического расщепления крахмала задерживается главным образом на стадии декстринов, а мальтозы образуется немного, тогда как под действием Р-амилазы расщепление идет в сторону преимущественного

образования мальтозы. Последовательно этот процесс можно представить следующим образом.

Мальтоза под действием фермента мальтазы (а-глю-козидазы) распадается на две молекулы a-D-глюкозы. Встречается также фермент глюкоамилаза, катализирующий распад крахмала до глюкозы.

Ход процесса гидролитического расщепления крахмала можно проследить с помощью реакций Троммера, Бенедикта или Ниландера (см. раздел VII), характеризующих восстанавливающие свойства углеводов.

При ферментативном гидролизе крахмала увеличивается количество свободных гликозидных гидроксилов, обусловливающих восстанавливающие свойства, и поэтому мальтоза и глюкоза способны восстанавливать окись меди до закиси, гидрат окиси висмута или окись серебра до металлов.

Реактивы: а) слюна. Свежую слюну разводят в 10 раз дистиллированной водой: б) крахмал, -ный раствор; в) раствор иода в иодистом калии (раствор Люголя): в нескольких миллилитрах воды растворяют 1 г иодистого калия, в концентрированном растворе соли растворяют 1 г иода и доливают водой до 300 мл; г) едкий натр, 5%-ный раствор; д) сернокислая медь -ный раствор.

В две пробирки наливают по -ного раствора крахмала, в одну из них добавляют 1 мл разведенной слюны (1: 10), в другую - 1 мл воды и ставят на 10 мин.

в водяную баню, нагретую до 37-38° (внимательно следят за температурой, не допуская ее повышения), или, еще лучше, в ультратермостат, после чего охлаждают пробирки под краном. Проделывают реакции Троммера и с иодом, для чего содержимое каждой пробирки делят пополам.

Инактивация ферментов высокой температурой.

Являясь белковыми веществами, ферменты весьма чувствительны к температуре, при которой протекает реакция. Температурный оптимум действия ферментов теплокровных животных составляет 37-38° С. При небольшом повышении температуры (например, 40-45° С) скорость ферментативных реакций вначале повышается, но уже при дальнейшем нагревании (выше 50° С) падает, а при 70-80° утрачивается. Кипячение влечет за собой полную потерю каталитической активности ферментов вследствие денатурации их белковой части (апоферментов). При температурах ниже нуля скорость ферментативных реакций значительно понижается, но сами ферменты не разрушаются и при осторожном оттаивании восстанавливают свою активность.

Реактивы: а) слюна, разведенная в 5 раз дистиллированной водой; б) крахмал, 1%-ный раствор; в) раствор иода в иодистом калии (см. предыдущую работу); г) реактивы для реакции Троммера (см. предыдущую работу).

В две пробирки наливают по 1 мл разведенной слюны. Содержимое одной из них нагревают до кипения и кипятят 2-3 мин. Затем в обе пробирки добавляют по 1 мл раствора крахмала и ставят на 10 мин. в водяную баню, нагретую до 38° С, после чего проделывают реакции Троммера и с иодом. Убеждаются, что в пробирке, в которой фермент был инактивирован кипячением, расщепления крахмала не произошло.

Специфичность действия ферментов.

Это одно из важнейших свойств ферментов. Каждый фермент воздействует лишь на определенное вещество или группу веществ, близких по своей структуре. Различают следующие виды специфичности: а) абсолютную, когда ферменты катализируют лишь одну реакцию превращения какого-либо вещества. Например, уреаза (карбамид - амидогидролаза) катализирует только реакцию гидролитического расщепления мочевины до аммиака и двуокиси

углерода; б) групповую, когда ферментом катализируются реакции превращения близких по своей структуре веществ, построенных по одному типу. Так, сахараза (Р-фруктофуранозидаза) катализирует реакцию гидролитического расщепления сахарозы с освобождением молекул глюкозы и фруктозы, но тот же фермент катализирует также реакцию частичного гидролиза трисахарида рафинозы (а-галактозидо-а-глюкозидо-р-фруктозида), при которой освобождается лишь молекула фруктозы, а связь между галактозой и глюкозой остается ненарушенной; в) стереохимическую, которая проявляется в том, что фермент катализирует реакцию расщепления или синтеза только одного из стереоизомеров, не воздействуя на другой. Окисление L-молочной кислоты до пировиноградной катализируется ферментом лактатдегидрогеназой, тогда как тот же процесс D-молочной кислоты катализируется другим ферментом - -лактатде-гидрогеназой.

Реактивы: а) слюна, разведенная в 10 раз дистиллированной водой; б) сахароза, 1%-ный раствор; в) крахмал, 1%-ный раствор; г) реактивы для реакции Троммера.

В две пробирки наливают по 1 мл разведенной слюны, затем в одну из них добавляют 1 мл раствора сахарозы, а в другую - столько же раствора крахмала. Обе пробирки прогревают 10 мин. в водяной бане при температуре 38° С, после чего охлаждают и с содержимым каждой из них проделывают реакцию Троммера. Убеждаются, что амилаза катализировала лишь процесс гидролитического расщепления крахмала и не оказала действия на сахарозу.

Влияние pH среды на активность амилазы слюны.

Каждый фермент проявляет максимум своего каталитического действия при строго определенном pH среды. Наивысшую активность многие ферменты проявляют в изоэлектрической точке.

Оптимальное значение pH для пепсина составляет 1,5-2,0, амилазы слюны -6,8-7,0, трипсина - 7,8, липазы поджелудочной железы - 7,0-7,8. Было, однако, показано, что ферменты, катализирующие одни и те же реакции, но выделенные из различных субстратов, проявляют оптимум действия при неодинаковых значениях pH. Так, оптимум действия кишечной сахаразы наблюдается

при pH 6,2, а сахаразы, выделенной из дрожжей, - при pH 4,6-5,0. Оптимум pH амилазы слюны составляет 6,8-7,0, а амилаза солода проявляет максимум каталитической активности при pH 4,4-4,5.

Реактивы: а) слюна, разведенная дистиллированной водой в 100 раз; б) крахмал, 0,5%-ный раствор; в) лимонная кислота, 0,1 М раствор (19,212 г кислоты в 1 л); г) фосфорнокислый натрий двузамещенный М раствор (содержит 36,62 г соли в 1 л); д) раствор Люголя (раствор иода в иодистом калии); е) хлористый натрий, 1%-ный раствор.

В 7 однотипных пробирок пипетками наливают растворы лимонной кислоты и фосфорнокислого натрия в количествах, указанных в табл. 4, получая таким образом буферные смеси со значениями pH от 5,6 до 8,0. В каждую пробирку добавляют по 10 капель 1 %-ного раствора хлористого натрия, 0,5%-ного раствора крахмала, разведенной в 100 раз слюны и перемешивают.

Табл. 4. Фосфатно-цитратные буферные смеси

Пробирки ставят на 10 мин. в водяную баню при температуре 38° С, после чего быстро охлаждают, добавляют во все пробирки по 1 капле раствора Люголя, перемешивают и наблюдают окраску. Устанавливают, при каком pH произошло наиболее полное расщепление крахмала (желтая или буровато-желтая окраска с иодом). Реакция весьма специфична и показательна.

C точки зрения эффективности применения биокатализаторов было бы крайне заманчиво не только повысить стабильность ферментов, но и научиться возвращать активность отработанным в ходе технологического процесса ферментативным препаратам.

Практически одновременно с обнаружением феномена инактивации ферментов (начало ХХ в.) исследователи стали предпринимать попытки их реактивации. К настоящему времени накоплено довольно много положительных примеров в этом направлении. Их удобно классифицировать согласно причинам, вызывающим инактивацию.

Реактивация агрегированных белков . Ее часто удается осуществить, разрушив межмолекулярные нековалентные контакты (гидрофобные, электростатические, водородные связи). Для этого используют те же денатуранты, которые разрушают нековалентные взаимодействия в нативных белках, вызывая их обратимую денатурацию: концентрированные растворы мочевины и гуанидин хлорида‚ экстремальные значения рН и т. п.

Реактивация белков с измененной первичной структурой . Если белок потерял активность в результате химической модификации функциональных групп, то можно попытаться реактивировать его с помощью обратной химической реакции. Ферменты, инактивированные путем модификации SH-групп (например, их окислением), иногда удается реактивировать, добавляя избыток низкомолекулярного тиола или другого восстановителя.

Десорбция инактивированного белка со стенок сосуда . «Сорбционная инактивация» белков обусловлена слабыми нековалентными взаимодействиями (электрическими, гидрофобными, водородными связями) между белком и поверхностью реакционной ячейки. Реактивация в этом случае достигается за счет разрушения неспецифических взаимодействий при экстремальных значениях pH, под действием концентрированных растворов мочевины или гуанидин хлорида и других реагентов, являющихся «обратимыми денатурантами» для большинства белков.

Реактивация «необратимо денатурированного» белка . Реактивацию удается провести, руководствуясь следующей двухстадийной схемой: сначала в инактивированном белке следует разрушить все, в том числе ненативные нековалентные взаимодействия, т. е. перевести белок в развернутое состояние и уже из этого состояния попытаться свернуть его в нативную конформацию. Таким образом, в общем случае задача о реактивации какого-либо «необратимо денатурированного» фермента, по существу, свалится к решению двух задач. Во-первых, поиску условий, при которых инактивированный белок удается развернуть. Для разворачивания инактивированных белков обычно используют те же реагенты, с помощью которых нативные (неинактивированные) белки можно перевести в состояние статистического клубка. Это концентрированные растворы обратимых денатурантов (мочевины или гуанидин хлорида). Во-вторых, экспериментальному подбору условий, в которых развернутый белок успешно сворачивается в нативную (каталитически активную) конформацию. Для этой цели часто полезными оказываются эффекторы ферментативной активности (субстраты, ингибиторы, кофакторы и т. п.)‚ которые одновременно являются и эффекторами сворачивания, т. е. повышают выход реактивации фермента.

Регенерация кофакторов (коферментов)

К категории кофакторов относятся коферменты, простетические группы и ионы металлов. С технологической точки зрения наибольший интерес представляет регенерация коферментов. Коферменты - это низкомолекулярные органические соединения, которые играют роль дополнительного субстрата в функционировании многих ферментов.

При использовании систем иммобилизованных ферментов с коферментами приходится решать две задачи: собственно регенерацию кофермента и его удержание в реакционной системе. Последнее обычно осуществляется путем ковалентной иммобилизации коферментов на полимерных носителях. Для регенерации разработано несколько подходов‚ суть которых отражается следующей схемой:

Согласно этой схеме кофермент, изменяющийся в реакции с участием одного из ферментов, благодаря системе сопряженных реакции регенерирует, т.е. принимает свое первоначальное состояние. В зависимости от типа сопряженной реакции все способы регенерации коферментов можно разделить на две группы: ферментативные и неферментативные. К ферментативным относятся способы регенерации с использованием сопряженных субстратов или сопряженных ферментов. Неферментативные пути можно подразделить на химические и электрохимические.

Система регенерации ATP – это непрерывный процесс превращения АДФ в АТФ, катализаторами в котором выступают ферменты, фосфорилирующие дифосфат, используя в качестве доноров фосфата фосфатсодержащие соединения (ацетилфосфат, креатинфосфат, аргининфосфат и т.д.).

Количество фермента, присутствующего в тканях в любой данный момент времени, определяется относи­тельными скоростями его синтеза и распада, а также кон­центрациями различного рода ингибиторов и активаторов. Как правило, распад ферментов и снижение их количества в среде происходят медленно. Ингибирование и активация ферментов могут осуществляться довольно быстро – в те­чение секунд.

Существует много методов для определения и выражения активности отдельных ферментов. Это обус­ловлено многообразием ферментов, наличием и использованием для определения их активности различных суб­стратов.

Международный биохимический союз предложил сле­дующее определение единицы фермента: «За единицу лю­бого фермента принимается то его количество, которое катализирует превращение одного микромоля субстрата в минуту при заданных стандартных условиях ». Число микромолей и будет равно числу стандартных единиц . Международная комис­сия предложила, если это возможно, проводить опре­деление активности фер­ментов при 30 °С и при оптимальных для фермен­тативной активности зна­чениях рН и концентра­ции субстрата.

Общие свойства фер­ментов вытекают из ихбелковой природы . Ферменты термолабильны, их активность зависит от рН среды и влажности , в которой они действуют, а также от влияния активаторов и ингибиторов .

При повышении температуры до определенных преде­лов активность ферментов усиливается . При достижении оптимальной для фермента температуры его каталитическая активность бывает наиболее высокой. Оптимальная температура для многих ферментов лежит чаще всего в пределах от 40 до 50 °С (оптимальная для растительных ферментов – 50 – 60 °С, а для ферментов животного происхождения – 40 – 50 °С). Однако оптимальная температура не является строго постоянной и зависит от многих при­чин, и в частности от продолжительности нагревания. Чем продолжительнее действие фермента, тем оптимальная температура должна быть ниже .

В интервале температур от 0 до 50 °С при повышении или понижении температуры на каждые 10 °С активность ферментов возрастает или соответственно падает в 1,4 – 2 раза. При дальнейшем нагревании активность ферментов снижается, и при 80 – 100 °С ферменты обычно полностью теряют каталитические свойства в связи с де­натурацией белка .

Температура инактивации (потери активности) у разных ферментов неоди­накова . Так, инактивация фермента амилазы в растворе происходит при 70 °С, сахаразы – при 59, трипсина и пепсина – при 65 °С. В сухом состоянии ферменты могут переносить нагревание до более высоких температур. Но при очень высоких температурах инактивация фер­ментов наступает мгновенно. При пастеризации, стерилизации, бланшировке и кипячении фермен­ты разрушаются .

После тепловой инактивации некоторые ферменты вос­станавливают свою каталитическую активность. Примером может служить пероксидаза, которая даже при нагревании в течение 60 с до 150 °С не полностью теряет каталитические свойства. Поэтому пероксидазу считают самым термостабильным ферментом.

При температурах ниже 0 °С каталитическая деятель­ность ферментов резко снижается, но все же сохраняется даже при замораживании продуктов .

Реакция среды оказывает существенное влияние на ка­талитическую активность ферментов. Ферменты изменяют свою растворимость, осмотическое давление, вязкость и другие свойства под влиянием рН среды. Полагают, что изменение ферментативной активности в зависимости от рН среды связано с изменением ионизации ферментов, суб­страта или фермент-субстратного комплекса .

Ферменты проявляют оптимальную активность только в определенных, свойственных им пределах рН . Так, пеп­син, который выделяется в сильнокислую среду желудка, имеет оптимум активности при рН 1,5 и 2,5. В то же время протеазы, которые выделяются поджелудочной железой в двенадцатиперстную кишку, имеют оптимальную актив­ность в щелочной зоне рН, а оптимум действия трипсина лежит в пределах рН 8 – 9. При значении рН выше или ниже оптимальной активность ферментов снижается .

Большинство ферментов бывают наиболее активными в нейтральных, слабощелочных или слабокислых средах. По мере сдвига значения рН от оптимальной в кислую или щелочную среду активность ферментов падает.

Активаторы и ингибиторы (парализаторы) ферментов могут соответственно усиливать или ослаблять и даже прекращать их деятельность. Активаторами ферментов являются ионы металлов: Na + , K + , Rb + , Mg 2+ , Ca 2+ , Cu 2+ , Fe 2+ и соединения, содержащие сульфгидрильные группы: SH, HCN, H 2 S . Наличие в растворе указанных металлов или соединений в определенной концентрации способствует проявлению полной активности некоторых фер­ментов.

Все ферменты подвержены ингибированию в ре­зультате денатурации или разрушения ферментного белка .

Сущность действия ингибиторов в большинстве слу­чаев состоит в том, что они соединяются с активными группами или активными центрами молекулы ферментов. Различают ингибиторы общего и специфического ха­рактера . К общим ингибиторам, которые подавляют дей­ствие всех ферментов , относят соли тяжелых металлов (свинца, серебра, ртути), трихлоруксусную кислоту и танин . Часто торможение или прекращение действия фер­ментов под влиянием тяжелых металлов носит обратимый характер, и если в среду добавить вещества, образующие соединения с этими металлами, то активность ферментов восстанавливается.

Специфические ингибиторы действуют только на опре­деленные ферменты. Так, синильная кислота действует только на окислительные ферменты, содержащие в актив­ном центре железо или медь. Синильная кислота вступает в соединение с металлами, и фермент теряет активность.

В живой клетке регулирование действия ферментов осуществляется не только с помощью специфических акти­ваторов и ингибиторов, но также путем связывания фер­ментов на различных коллоидных структурах прото­плазмы. Такое связывание ферментов приводит к потере ими активности. Освобождение фермента из соединения вновь восстанавливает его каталитическую активность.

Ферменты инактивируются при очень высоких давлениях . Однако после снятия давления ферменты восста­навливают свою каталитическую активность.

Действие ферментов сильно замедляется в сухих про­дуктах, однако полностью не прекращается . Результаты активности ферментов могут проявляться в изменении качества продукта – его потемнении, ухудшении аро­мата, вкуса, консистенции и т. д.

Скорость большей части ферментальных реакций про­порциональна концентрации фермента, по крайней мере, на самых ранних стадиях. За пределами начальных ста­дий скорость ферментативных реакций падает.

Фермент образует с субстратом комплекс, который диссоциирует на свободный фермент и конечный продукт реакции:

где Е – фермент; S – субстрат; ЕS – ферментно-субстратный комплекс; Р – конечный продукт.

Количество субстрата очень велико по сравнению с ко­личеством фермента, и поэтому концентрация субстрата сильно влияет на скорость ферментативных реакций. Если субстрат содержится в значительном избытке, то коли­чество образующегося продукта пропорционально вре­мени. По мере уменьшения концентрации субстрата ко­личество образующегося в единицу времени конечного продукта (Р) снижается.

О наличии в растворе фермента судят по его действию. Так, о наличии амилазы в слюне можно судить по спо­собности слюны осахаривать крахмал, о наличии желу­дочного пепсина – по его способности растворять с до­статочной быстротой яичный белок или фибрин.

Регулируя активность ферментов созданием соответствующей реакции среды, можно управлять скоростью катализируемых ими реакций, а также деятельностью ферментов, содержащихся в пищевых продуктах, что позволяет осуществлять мероприятия по хранению зерна, картофеля, плодов и овощей, производству ряда продуктов (вина, чая и т. д.).

Номенклатура и классификация ферментов

В начальный период развития учения о ферментах им давали названия без определенной системы, по случай­ным признакам, по названию субстрата или типу катали­зируемой реакции. Так, фермент пепсин получил назва­ние от греческого слова «пепсис» – перевариваю, папаин – от сока растения папайи, богатого ферментом. Случалось, что отдельные авторы одному и тому же фер­менту давали разные названия.

В связи с бурным развитием науки о ферментах – фер­ментологии в 1961 г. постоянным комитетом по ферментам при Международном биохимическом союзе была разра­ботана современная номенклатура и классификация ферментов. В соответствии с этой классификацией название фермента составлялось из химического названия суб­страта и названия той реакции, которая осуществлялась ферментом. К латинскому названию корня субстрата, на который действует фермент (сахароза – сахараза), или к названию процесса, катализируемого данным ферментом (гидролиз – гидролазы), добавлялось окон­чание «аза» . Наряду с новыми названиями для многих ферментов сохранились старые, прочно вошедшие в науч­ную литературу (пепсин, трипсин, папаин и др.).

По современной классификации все ферменты делят на шесть классов: оксидоредуктазы; трансферазы; гидро­лазы; лиазы; изомеразы; лигазы (синтетазы) . Классифи­кация ферментов основана на характере их действия.

Каждый класс подразделяют на подклассы, а каждый подкласс – на группы .

Оксидоредуктазы

Это ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции , которые проис­ходят в живых организмах. Реакции окисления веществ в организмах всегда сопровождаются реакциями восста­новления. Оксидоредуктазы делят на 14 подклассов (наиболее обширный класс ферментов).

Окисление протекает как процесс отнятия водорода (электронов) от субстрата, а восстановление – как при­соединение атомов водорода (электронов) к акцептору. Эту реакцию схематично можно представить в следующем виде:

АН 2 + В = А + ВН 2 ,

где АН 2 – вещество, отдающее свой водород и называемое донатором; В – вещество, отнимающее водород и назы­ваемое акцептором.

Окислению могут подвергаться разнообразные веще­ства – углеводы, жиры, белки, аминокислоты, вита­мины и др.

Роль оксидоредуктаз в живых тканях выполняют об­ширные группы дегидрогеназ и оксидаз , которые носят название в зависимости от окисляемого ими субстрата. Так, фермент, дегидрирующий яблочную кислоту, назы­вается малатдегидрогеназой, дегидрирующий этиловый спирт – алкогольдегидрогеназой и т. д.

В классе оксидоредуктаз основное значение имеют дегидрогеназы, которые осуществляют реакцию дегидри­рования. Все дегидрогеназы делят на две группы : анаэроб­ные и аэробные, которые называют оксидазами .

Анаэробные дегидрогеназы представляют собой спе­цифические ферменты, катализирующие отщепление водо­рода от определенных химических веществ и передающие его другим ферментам – переносчикам водорода. Эти де­гидрогеназы являются двухкомпонентными ферментами, в которых кофермент легко отделяется от белковой части. В качестве кофермента в состав анаэробных дегидрогеназ могут входить два вещества – никотин-амид-аденин-нуклеотид (НАД ) или никотин-амид-аделинин-нуклеотид-фосфат (НАДФ ). Оба эти вещества обладают исключительно вы­сокой реакционной окислительно-восстановительной спо­собностью.

Известно очень много анаэробных дегидрогеназ, ката­лизирующих окисление различных органических соедине­ний. Так, лактатдегидрогеназа катализирует реакцию окисления молочной кислоты до пировиноградной, изоцитратдегидрогеназа – окисление изолимонной кислоты до щавелево-янтарной.

К группеаэробных дегидрогеназ (оксидаз) относят ферменты, в состав которых в качестве кофермента входит витамин В 2 , (рибофлавин ), поэтому такие ферменты назы­вают флавиновыми . Флавиновые ферменты способны отни­мать водород от окисляемого вещества и передавать его другим соединениям или кислороду воздуха:

2Н 2 О 2 → 2Н 2 О + О 2 .

Отнимая водород от окисляемого вещества и передавая его кислороду воздуха, оксидаза может при этом образо­вывать воду или перекись водорода (Н 2 О или Н 2 О 2). К этой группе ферментов относятся полифенолоксидаза, аскорбинатоксидаза, глюкооксидаза.

Полифенолоксидаза представляет собой аэробную дегидрогеназу, для которой акцептором водо­рода является газообразный кислород .

Она действует на о-дифенолы, полифенолы, дубильные вещества и тирозин. Полифенолоксидаза широко распро­странена в грибах и высших растениях, особенно ее много в зеленом чайном листе. Действием полифенолоксидазы объясняется потемнение на разрезе мякоти плодов и ово­щей, картофеля, а также потемнение свежего чайного листа при его скручивании. Полифенолоксидаза играет большую роль в качестве промежуточного звена при дыха­нии растений.

Фермент пероксидаза наряду с полифенолоксидазой и цито­хромоксидазой активно участвует в процессах дыхания растений и защитных реакциях растений против фитопатогенных микроорганизмов растений.

Активная группа пероксидазы содержит железо . С по­мощью фермента пероксидазы за счет перекиси водорода и некоторых других органических перекисей происходит окисление органических соединений. Пероксидаза обра­зует комплексное органическое соединение, вследствие чего перекись активируется и приобретает способность действовать как акцептор водорода:

Многие органические соединения реагируют с кисло­родом воздуха и образуют перекиси. Особенно легко обра­зуются перекиси при окислении кислородом воздуха соединений, имеющих непредельные связи: каротиноидов, ненасыщенных жирных кислот, некоторых углеводородов.

Фермент каталаза катализирует процесс расщеп­ления перекиси водорода на воду и кислород:

В состав молекулы каталазы, как и пероксидазы, вхо­дит железо . Главное назначение каталазы в организме состоит в том, что она разрушает вредную для клеток перекись водорода, образующуюся в процессе дыхания.

Фермент липоксигеназа катализирует образо­вание перекисей и гидроперекисей при окислительной порче жиров.

Все воздействия, приводящие к инактивации ферментов, иногда условно подразделяют на физические и химические. К физическим относят нагревание или переохлаждение, облуче­ние (у- и рентгеновское излучение), ультразвук, сорбцию на

границах раздела фаз (типа вода - воздух или жидкость -жидкость). Химическая инактивация может быть вызвана, на­пример, щелочами к кислотами, поверхностно- активны ми веще­ствами, органическими растворителями, мочевиной и гуанидин-хлоридом, некоторыми окислителями (например, кислородом или пероксидом водорода) и восстановителями (например, тиолами, ионами металлов), а также некоторыми ферментами (например, протеазами или протеинкиназами). Однако попытка классифи­цировать инактивационные процессы, основываясь на условном разделении инактивирующих воздействий на физические и хими­ческие, практически ничего не дает для понимания сути этих процессов. Так, например, под действием физического фактора (нагревания) в молекуле белка часто происходят химические изменения; окисление функциональных групп, гидролиз пептид­ных связей, С другой стороны, действие таких химических дена-турантов, как мочевина или гуанндин хлорид, как правило, вы-зывает изменения только физического состояния белка (конфор-мационные перестройки), но не меняет его химическую струк­туру.

Более информативной, с точки зрения решения стабилиза­ционной задачи, является классификация инактивационных про­цессов по молекулярным механизмам.

§ 2. Молекулярные механизмы инактивации ферментов

Еще в 40-х - - начале 50-х годов сложились основные пред­ставления о механизмах инактивации. В наиболее общем случае инактивационный процесс можно представить в виде двухстадий-ной схемы:

где N, D и 1-соответственно нативная, обратимо денатури­рованная и необратимо инактнвированная формы белка*. Первая стадия на схеме (!) чаще всего представляет собой обратимое конформационное изменение; в случае олигомерных ферментов эта стадия состоит в обратимой диссоциации на субъ­единицы. Вслед за обратимыми процессами протекают необрати­мые стадии (D-Л)< Механизмы инактивации ферментов, как правило, классифицируют, исходя из природы процессов, про­исходящих именно на второй, необратимой стадии. Кратко рас­смотрим основные ииактивационные механизмы.

Агрегация. Очень часто при длительной инкубации в растнорс при повышенной температуре, при экстремальных значениях pH t

* Термин <кнеобратимость» по ей ношению к инактивации имеет т\гт смысл, что после снятия инактиоанионншо воздействия (например, прн понижении температуры после 1фод<мжнтельн^го нагревания) фермент не втвращается h иатнвной каталитически активной информации N. Он остается в неактивной фор­ме 1 и в течение разумных времен наблюдения (часы. с\тки) ш- списобен само произвольно реактивироваться, т, е. перейти в форму N,"

в присутствии химических денатурантов белки агрегируют. На возможность такой инактивации оказывает влияние целый ряд факторов: температура, рН и т. п.; однако решающим среди них является концентрация белка. Поскольку кинетиче­ский порядок уравнения, описывающего стадию агрегации, равен или даже больше двух, то, естественно, увеличение концентрации белка приводит к увеличению скорости агрегации и размеров образующихся агрегатов, а также ускорению инактивации в целом. По этому характерному признаку (сильная зависимость скорости инактивации от концентрации фермента в растворе) можно кинетически отличить агрегацию от мономолекулярных инактивационных механизмов.

Как правило, белковые агрегаты образуются за счет слабых нековалентных взаимодействий, таких, как гидрофобные взаимо­действия, водородные связи. Однако если в молекулах белков имеются SH-группы или дополнительно к ним еще S-8-связи т то отдельные молекулы внутри агрегатов могут сшиваться ко-валентными дисульфидными мостиками. Размер и форма некова-лентных или ковалентпо-сшитых агрегатов могут изменяться в широких пределах вплоть до образования отдельной фазы - белковых осадков.

Изменение первичной структуры. Все химические процессы, приводящие к инактивации белков, можно подразделить на две группы. К первой относятся реакции разрыва пол и пептидной це-почки т ко второй - химическая модификация отдельных функ­циональных групп белка.

Гидролиз пептидных связей, протеолиз и автолиз. Не катали­тическое растепление пептидных связей проходит в очень-жест­ких условиях. Так, полного расщепления полипептидной цепи на отдельные составляющие аминокислоты добиваются лишь пу­тем длительного (многочасового) кипячения раствора белка в концентрированной соляной кислоте. В несколько более «мягких» условиях, при нагревании белковых растворов при нейтральных или слабощелочных рН и температуре 80-100°С, гидролиз пеп­тидных связей либо проходит лишь незначительно, либо его вооб­ще не наблюдается. Из всех пептидных связей наиболее лабиль­ными к высокотемпературному гидролизу, как правило, оказыва­ются те, которые образованы остатками аспарагиновой кислоты.

Однако гидролиз пептидных связей в белках может происхо­дить и при нормальных условиях - комнатной температуре, нейтральных значениях рН. Это является результатом работы протеаз - ферментов, созданных природой для деградации дру­гих белков в мягких условиях. Поскольку в любых (даже высоко-очищенных) препаратах белков могут находиться протеазы в ка­честве сопутствующих примесей, при изучении механизмов инак­тивации необходимо учитывать и возможность протеолиза. ф Другим примером протеолитической инактивации может слу­жить бактериальное заражение реакторов, содержащих фер­менты. Случайно попавшие в реактор клетки микроорганизмов

Секретируют протеазы, которые расщепляют молекулы фермента-биокатализатора, находящегося в растворе. Используя «осколки» протеолитической деградации в качестве питательной среды для роста, микроорганизмы размножаются; тем самым они, с одной стороны, «засоряют» реактор, с другой - уменьшают активность биокатализатора в растворе, т. е. инактивируют его.

Сами протеолитические ферменты способны расщеплять не только молекулы других белков, но и себе подобные- Этот про­цесс «саморасщепления» протеаз получил название автолиз а. От большинства других инактивационных механизмов (за исклю­чением агрегации) автолиз можно отличить кинетически. Дело в том, что существенной стадией при автолизе является обра­зование комплекса между двумя молекулами п роте азы; эта би­молекулярная стадия часто определяет общую скорость инакти­вации. Поэтому, если при изменении начальной концентрации протеаяы наблюдается изменение скорости инактивации* то изучаемый ннактивационный процесс с большой вероятностью представляет собой автолиз.

Окисление функциональных групп фермента. При повышен­ных температурах некоторые функциональные группы в белках, и в первую очередь SH-группы цистеина и индольные фрагменты триптофана, окисляются. В результате окисления образуются модифицированные производные аминокислот; сульфоксисоеди-нения цистеина (SOH, SCW и т. д.), продукты раскрытия ин-дольного кольца триптофана и др. В некоторых ферментах сульф-гидрильные группы, входящие в состав активного центра, обла­дают повышенной реакционной способностью и окисляются даже при комнатной температуре.

Расщепление S-S-связей в белках. Расщепление может про­исходить либо в восстановительной среде (в присутствии тиолов, других восстановленных соединений серы, например ЫагЭОз, NaACbh либо в щелочной среде при повышенной температуре. В первом случае продуктом восстановления S-S-связи является ее тиольная форма {белок -SH) либо смешанный дисульфид тиольной формы белка с восстанавливающим реагентом (белок -S-S-R; белок -S-SOr и т. п,). При щелочном расщепле­нии S-S-связей пр!оисходит более сложная цепь химических реакций. Сначала цистин гидролизуется с образованием дегидро-аланина:

i-СНг-СН<^ + ОН ~ -* ЧСН-CH^S-S~ + СН г = С

который, как нуклеофил, взаимодействует с аминогруппами остатков лизина, сульфгидрильными группами остатков цистеина, гуанидиниевыми группами остатков аргинина, образуя новые аминокислоты, соответственно, лизиноаланин, лантионин н орни-тниоаланин:

соон ч хоон

Haugaard в 1946 г. показал, что ферменты, активность которых зависит от присутствия восстановленных форм сульфгидрильных групп, необычно чувствительны к токсическому действию кислорода. В 1972 г. Tjioe, Haugaard пришли к выводу о связи инактивации таких ферментов при действии О2 под абсолютным давлением 5 кгс/см2 с исчезновением активных сульфгидрильных групп.

В легких у крыс под воздействием гипероксии (PiО2=5 кгс/см2) активность гидрогеназы и содержание сульфгидрильных групп были значительно снижены после 15-30 мин экспозиции, и при этом в тканях отмечали не макроскопические, а только небольшие микроскопические изменения. После 45 мин экспозиции наблюдали поражение легких и увеличение содержания бисульфидов.

Кроме ферментов , содержащих активные сульфгидрильные группы, под влиянием гипероксии, как известно, инактивируются многие другие ферменты. Возможно также, что потенциально активные радикалы могут вызывать необратимые поражения пептидных цепей и особенно аминокислот .

Пероксидация лнпидов

Взаимодействие ненасыщенных липидов с переокисленным анионом или с некоторыми другими свободными радикалами может вначале привести к высвобождению липидного радикала, а затем в результате самоокисления в присутствии кислорода образовать липидный пероксидный радикал . Дальнейшее взаимодействие перекиси липидов с другими липидами способно циклически регенерировать липидные свободные радикалы и перекисные соединения, вызывая тем самым цепную реакцию и прогрессирующее переокисление липидов.

Kovachich, Mishra (1980) показали, что переокисление липидов в срезах мозга крыс появляется даже во время экспозиции в условиях нормального давления воздуха с накоплением перекисных соединений в среде, так же как во внутриклеточной жидкости. Хотя вызванное действием кислорода переокисление липидов еще не продемонстрировано с определенной ясностью in vivo, в литературе имеются сообщения, что оно может иметь место в ткани мозга, эритроцитах, пузыре лягушки и в изолированном легком крысы.

В литературе имеется множество сообщений о том, что связанные с мембраной активные транспортные системы имеют тенденцию к инактивации под влиянием кислорода. Точно установлено, что потребление солей глутаминовой кислоты зависит от транспортной системы, связанной с переносом калия . В 1957 г. Kaplan, Stein на срезах коры головного мозга морских свинок, подвергнутых воздействию кислорода под абсолютным давлением 6 кгс/см2 в течение 90 мин, обнаружили как нарушение процессов потребления тканями солей глутаминовой кислоты, так и накопления калия.

Аналогичные закономерности были установлены в 1970 г. Joanny и сотрудниками на кортикальных срезах мозга, подвергнутых воздействию кислорода под абсолютным давлением в диапазоне 1-10 кгс/см2. Из литературных сообщений известно также о повреждениях активного транспорта натрия в препарате пузыря жабы и в изолированном лоскуте кожи лягушки под влиянием гипероксии. В 1973 г. Allen и сотрудники пришли к выводу, что наиболее вероятный механизм инактивации транспорта натрия под влиянием кислорода состоит в образовании промежуточных продуктов перекисей липидов.

На нарушение натриевого насоса мембраны клеток в кортикальных срезах, взятых у крыс, подвергнутых гипероксии под абсолютным давлением 4 кгс/см2, указывает наблюдаемое явление инактивации Na-K-АТФазы.

Усвоение как серотонива , так я вор-адреналина в изолированно перфузируемом препарате легких, взятом у крыс, подвергнутых действию кислорода под абсолютным давлением 1 кгс/см2, снижается . Оба этих изменения были значительными в пределах 12-24-часовой экспозиции, т. е. задолго до наступления структурных повреждений или появления клинических симптомов кислородного отравления легких.

Наоборот, клиренс имипрамина не изменялся в изолированных легких у крыс, которые дышали чистым кислородом при нормальном атмосферном давлении в течение около 48 ч . Полученные результаты согласуются с возможностью активного транспорта серотонина и норадреналина в эндотелиальных клетках легочных капилляров, в то время как удаление имипрамина происходит путем пассивного связывания . Кроме того, цитируемые авторы обнаружили, что токсическое влияние кислорода на мембрану эндотелиальных клеток распространяется либо не на один переносчик, либо на некоторые основные компоненты, вовлеченные в транспорт обоих аминов.