A StarCraft stratégiai számítógépes játék univerzumában a földönkívüli Zerg faj figyelemre méltó, mert megtanulta felszívni más élőlények genetikai anyagát és átalakítani saját génjeit, változtatva és alkalmazkodva az új körülményekhez. Ez az első pillantásra fantasztikus ötlet sokkal közelebb áll az élő szervezetek valós lehetőségeihez, mint amilyennek látszik.
Ma már sokat tudunk a DNS-ről: több mint kétmillió tudományos publikációt szentelnek ennek a kétszálú molekulának. A DNS-molekula négybetűs ábécé (nukleotidok) segítségével írt szövegnek tekinthető. Bármely szervezet kromoszómáit alkotó nukleotidok összességét genomnak nevezzük. Az emberi genom körülbelül hárommilliárd „betűből” áll.
A genom külön szakaszai izolált gének - funkcionális elemek, amelyek leggyakrabban specifikus fehérjék szintéziséért felelősek. Az embernek körülbelül 20 000 fehérjét kódoló génje van. A fehérjék a DNS-molekulákhoz hasonlóan polimerek, de nem nukleotidokból, hanem aminosavakból állnak. A fehérjéket alkotó aminosavak "ábécéje" 20 molekulából áll. Egy gén nukleotidszekvenciájának ismeretében pontosan meghatározható az általa kódolt fehérje aminosavszekvenciája. A tény az, hogy minden organizmus ugyanazt (kis eltérésekkel) jól tanulmányozott genetikai kódot használja - a kodonok (nukleotidhármasok) egyes aminosavakhoz való illesztésének szabályait. Ez a sokoldalúság lehetővé teszi, hogy az egyik szervezet génjei egy másik szervezetben működjenek, és továbbra is ugyanazt a fehérjét termeljék.
természettechnika
A növények géntechnológiájának egyik fő módszere az agrobaktériumokat és az általuk kifejlesztett növényi genomok módosulási mechanizmusát alkalmazza (lásd „PM” No. 10 „2005). A talajban élő agrobaktériumok génjei speciális fehérjéket kódolnak, amelyek képesek „húzni” "egy bizonyos DNS-molekulát egy növényi sejtbe, beágyazzák a növény genomjába, és ezáltal rákényszerítik a növényt a baktériumoknak szükséges tápanyagok előállítására. A tudósok kölcsönvették ezt az ötletet, és úgy alkalmazták, hogy a baktériumoknak szükséges géneket olyan génekkel helyettesítik, amelyek olyan fehérjéket kódolnak, amelyek a mezőgazdaságban szükségesek.Például Bt-toxinok, amelyeket a talajbaktériumok termelnek Bacillus thuringiensis, amelyek teljesen biztonságosak az emlősök számára és mérgezőek egyes rovarok számára, vagy olyan fehérjék, amelyek ellenállóvá teszik a növényt egy adott gyomirtó szerrel szemben.
A baktériumok géncseréje, még ha nem is rokonok, nagyon gyakori jelenség. Ennek köszönhető, hogy a penicillinnel szemben rezisztens mikrobák a tömeges használat megkezdése után néhány éven belül megjelentek, és mára az antibiotikum-rezisztencia problémája az egyik legriasztóbb problémává vált az orvostudományban.
A vírusoktól a szervezetekig
A természetes "géntechnológiát" nemcsak baktériumok, hanem vírusok is végzik. Számos organizmus, köztük az ember genomjában is találhatók transzpozonok – egykori vírusok, amelyek régóta beépültek a gazdaszervezet DNS-ébe, és általában anélkül, hogy károsítanák azt, a genom egyik helyéről a másikra „ugrálhatnak”.
A retrovírusok (például a HIV) közvetlenül beilleszthetik genetikai anyagukat az eukarióta sejtek (például emberi sejtek) genomjába. Az adenovírusok nem ágyazzák be genetikai információikat az állatok és növények genomjába: génjeik e nélkül is bekapcsolhatnak és működhetnek. Ezeket és más vírusokat aktívan használják a génterápiában számos örökletes betegség kezelésére.
Így a természetes géntechnológiát nagyon széles körben alkalmazzák a természetben, és óriási szerepet játszik az élőlények környezethez való alkalmazkodásában. Ennél is fontosabb, hogy minden élő szervezet folyamatosan genetikai változásokon megy keresztül véletlenszerű mutációk következtében. Ebből egy fontos következtetés következik: valójában minden élőlény (a klónok kivételével) egyedi és genetikailag módosított őseihez képest. Új mutációi és a korábban létező génváltozatok új kombinációi is vannak – minden gyermek genomjában több tucat olyan genetikai változatot találnak, amelyek egyik szülőjének sem volt. Az új mutációk megjelenése mellett az ivaros szaporodás során minden generációban a szülőkben már meglévő genetikai változatok új kombinációja jön létre.
Kísérletekben tesztelve
Manapság aktívan vitatják a géntechnológiával módosított szervezeteket (GMO-kat) tartalmazó élelmiszerek biztonságosságát. Az ember által végzett géntechnológia termékei esetében a "géntechnológiával módosított szervezetek" kifejezés sokkal jobban megfelel, mivel a géntechnológia lehetővé teszi a természetben önállóan előforduló genetikai változások folyamatainak felgyorsítását, és azok megfelelő irányba irányítását az ember számára. . A genetikai modernizáció mechanizmusai és a génmódosítás természetes folyamatai között azonban nincs jelentős különbség, így megalapozottan feltételezhető, hogy a GM élelmiszerek előállítása nem hordoz további kockázatokat.
Azonban, mint minden tudományos hipotézis, a GMO-k biztonsága is kísérleti igazolást igényel. A GMO-k ellenzőinek számos kijelentésével ellentétben ezt a kérdést több mint egy tucat éve nagyon-nagyon alaposan tanulmányozták. Idén a magazinban Kritikai áttekintések a biotechnológiában csaknem 1800 tudományos közlemény áttekintését tette közzé a GMO-k biztonságának tanulmányozásáról az elmúlt tíz év során. Mindössze három tanulmány vetette fel három konkrét GM-fajta negatív hatásának gyanúját, de ezek a gyanúk nem igazolódtak, további két esetben a GM-fajták lehetséges allergenitását állapították meg. Az egyetlen megerősített eset az volt, hogy a brazil dió génjét génmódosított szójababfajtába inszertálták. Az ilyen esetekben az allergiások vérszérumának egy új génmódosított fajta fehérjére adott reakcióját vizsgáló standard teszt kimutatta a veszély fennállását, és a fejlesztők megtagadták a fajta piaci népszerűsítését.
Emellett külön érdemes megemlíteni a folyóiratban megjelent 2012-es áttekintést Élelmiszer- és kémiai toxikológia, amely 12 tanulmányt tartalmazott a GMO-élelmiszerek biztonságosságáról több (két-öt) állatgenerációban, és további 12 állatkísérletet a GMO-k élelmiszerekben való hosszú távú (három hónaptól két évig történő) fogyasztásával kapcsolatban. A felülvizsgálat szerzői arra a következtetésre jutottak, hogy a GMO-knak nincs negatív hatása (a nem modernizált megfelelőihez képest).
Botrányos leleplezések
Érdekességek merülnek fel néhány olyan alkotás körül, amelyek állítólag egyes GM-növényfajták káros hatásait mutatják be. Tipikus példa, amelyet a GMO-k ellenzői előszeretettel emlegetnek, Séralini francia kutató szenzációs publikációja a folyóiratban. Élelmiszer- és kémiai toxikológia, aki azt állította, hogy a génmódosított kukorica rákot okoz és növeli a mortalitást patkányokban. A tudományos közösségben Seralini munkája heves vitákat váltott ki, de nem azért, mert a kutató kapott és publikált néhány egyedi adatot. Ennek oka az volt, hogy a munka tudományos szempontból rendkívül gondatlanul történt, és durva, első látásra észrevehető hibákat tartalmazott.
Ennek ellenére a Séralini által bemutatott, nagy daganatos patkányokról készült fényképek óriási benyomást tettek a közvéleményben. Annak ellenére, hogy cikkét nem bírta elviselni az objektív kritikát és visszavonták a folyóiratból, továbbra is a GMO-ellenesek idézik, akiket nyilvánvalóan nem érdekel a kérdés tudományos oldala, és beteg patkányokról készült fényképeket továbbra is mutatnak a képernyőket.
A GMO-k lehetséges veszélyeiről szóló viták tudományos szintje a médiában és a társadalom egészében naivitásában feltűnő. Az üzletek polcain keményítőt, sót és még „nem GMO” vizet is találhatunk. A GMO-kat folyamatosan összekeverik a tartósítószerekkel, növényvédő szerekkel, műtrágyákkal és élelmiszer-adalékanyagokkal, amelyekhez a géntechnológia közvetlenül nem kapcsolódik. Az élelmiszerbiztonság valós problémáitól az ilyen viták a spekuláció és a fogalmak helyettesítésének birodalmába vezetnek.
Veszélyek – valósak és nem
Azonban sem ez a cikk, sem más tudományos közlemények nem próbálják bebizonyítani, hogy a GMO-k „teljesen biztonságosak”. Valójában egyetlen étel sem teljesen biztonságos, mert még Paracelsus is mondta a híres mondatot: „Minden méreg, és semmi sem mentes a méregtől; egy adag láthatatlanná teszi a mérget. Még a közönséges burgonya is allergiát okozhat, a zöld pedig mérgező alkaloidokat - szolanint - tartalmaz.
Megváltozhat-e valamilyen módon a meglévő növényi gének munkája egy új gén beépítése következtében? Igen, lehetséges, de egyetlen szervezet sem mentes a gének munkájában bekövetkező változásoktól. Képes-e a géntechnológia előállítani egy új növényfajtát, amely túlterjed a mezőgazdasági területeken, és valamilyen módon hatással lesz az ökoszisztémára? Elméletileg ez lehetséges, de a természetben mindenhol előfordul: új fajok jelennek meg, az ökoszisztémák megváltoznak, egyes fajok kihalnak, mások veszik át a helyüket. Nincs azonban ok azt hinni, hogy a géntechnológia további kockázatokat jelentene a környezetre vagy az emberek vagy állatok egészségére nézve. De ezeket a kockázatokat folyamatosan kürtölik a médiában. Miért?
A GMO-piac nagyrészt monopolizált. Az óriások között a Monsanto áll az első helyen. Természetesen a GM vetőmagok és technológiák nagy gyártói a profitban érdekeltek, megvannak a maguk érdekei, saját lobbijuk. De nem „levegőből” keresnek pénzt, hanem progresszív mezőgazdasági technológiákat kínálnak az emberiségnek, amelyekre a termelők a legmeggyőzőbb módon szavaznak - dollárban, pesóban, jüanban stb.
Az elavult technológiával termesztett, ezért drágább (de nem jobb) "bio" termékek fő gyártói és beszállítói szintén nem a kistermelők, hanem ugyanazok a több milliárd dolláros forgalmú nagyvállalatok. Csak az USA-ban a biotermékek piaca 31 milliárd dollár volt 2012-ben. Ez egy komoly üzlet, és mivel a biotermékeknek nincs semmi előnyük a GMO-kkal szemben, viszont előállításuk költségesebb, így piaci módszerekkel nem versenyezhetnek a GM fajtákkal. . A hiszékeny fogyasztókat tehát a médián keresztül a mitikus „skorpiógénektől” való megalapozatlan félelemmel kell inspirálnunk, ami igényt teremt a drága és alacsony technológiájú „biotermékek” iránt. Ezenkívül a GMO-ellenesek a géntechnológiával módosított, fehérjét termelő fajták szörnyű veszélyeit írják le. B. thuringiensis, általában elfelejtik megemlíteni, hogy az „ökológiai gazdálkodásban” megengedettek (és széles körben használják) az ilyen növényeken vagy az azokból izolált fehérjéken alapuló készítmények. Valamint a természetes trágya, amely egy csomó kórokozó baktérium és más természetes iszap forrása lehet.
Egy kis politika
Ma a géntechnológia az egyik legtöbbet tanulmányozott technológia a biztonság szempontjából. Lehetővé teszi a jobb élelmiszerek előállítását, a szántóföldeken felhasznált növényvédő szerek mennyiségének csökkentését és a környezet védelmét (igen, védeni: a Bt-fajtákkal bevetett táblákon több rovar és madár él, mint a "rendes" táblákon, amelyek rendszeresen kell kezelni rovarölő szerekkel) .
De van egy másik oka is a GMO-k elleni „harcnak” – kizárólag politikai. A biotechnológia terén messze lemaradó országok próbálnak ürügyet találni arra, hogy a más országokból származó olcsóbb termékeket távol tartsák piacaikról. A hazai termelők külföldi termékektől való ilyen védelme azonban csak akkor van értelme, ha időt nyerhet saját technológiájuk versenyképes állapotba hozására. Ha ez nem történik meg, komoly a veszélye annak, hogy lemaradunk a tudományos és technológiai világszintről. Örökké.
"Genomszerkesztők". A cink ujjaktól a CRISPR-ig
A genetikai anyag manipulálására szolgáló módszerek megjelenése valódi forradalmat jelentett a biológiában, a biotechnológiában és az orvostudományban. Az élő szervezetek genomjába történő célzott beavatkozás sokféle probléma megoldását tette lehetővé az új értékes tulajdonságokkal rendelkező módosított baktérium-, növény- és állatfajok létrehozásától, az új gyógyszerek létrehozásához szükséges sejtmodellek létrehozásától a a veleszületett genetikai rendellenességek korrekcióját nyitó génterápiás módszerek kidolgozása.
De ahhoz, hogy sikeresen behatolhassunk a sejt "szentek szentjébe" - annak örökletes anyagába - olyan technológiákra van szükség, amelyek lehetővé teszik a DNS-molekulák felosztását és összekapcsolását meghatározott területeken. Egy igazán forradalmi áttörés ezen a területen mindössze néhány évvel ezelőtt következett be, amikor a „bakteriális immunitás” mechanizmusaira alapozva egy egyszerű CRISPR/Cas géntechnológiai módszert fejlesztettek ki, amely precíz hatást biztosít meghatározott DNS-régiókra. Ezzel a módszerrel alapvetően új lehetőségek nyíltak meg a magasabb rendű élőlények genom szintű manipulációiban, lehetővé téve pontmutációk beiktatását, fragmentumok, sőt egész gének korrigálását, beillesztését vagy törlését.
Ahhoz, hogy sikeresen behatolhassunk a sejt „szentek szentjébe” – annak örökletes anyagába – olyan technológiákra van szükség, amelyek lehetővé teszik a DNS-molekulák felosztását és összekapcsolását meghatározott területeken.
Ebből a célból használhat restrikciós enzimeket – olyan enzimeket, amelyek képesek felismerni bizonyos rövid nukleotidszekvenciákat, és ezek mentén elhasítani egy DNS-molekulát. A nukleotid-fragmensek összekapcsolására DNS-ligáz enzimeket használnak, amelyek a DNS-szerkezet károsodását korrigáló (helyrehozó) természetes enzimkomplexek részét képezik. A DNS „térhálósítását” a rekombinációs rendszer enzimkomplexei is végrehajthatják, aminek köszönhetően a genomiális DNS összetételében a homológ fragmentumok cseréje a csírasejtek képződése során megy végbe.
A restrikciós enzimek és DNS-ligázok felfedezése az 1960-as és 1970-es években. lendületet adott a géntechnológia megjelenésének: ezen enzimek segítségével a DNS-t előre meghatározott fragmentumokra lehetett felhasítani, majd újra összekapcsolni, új genetikai konstrukciókat képezve. Így fogadták (és kapják most is) a bakteriális és vírusgenomok különféle változatait.
Ez az eszközkészlet azonban rendkívül nehéznek bizonyult a magasabb rendű szervezetek nagy, összetett genomjainak manipulálására. A probléma az volt, hogy a restrikciós enzimek csak viszonylag rövid DNS-szekvenciákat képesek "felismerni". Ez a specifitás elégséges a vírusok és baktériumok rövid DNS-ével való munkához, mivel ugyanazon a bakteriális DNS-en belül a specifikus rövid nukleotidszekvenciák nem túl gyakoriak. Ezért szinte mindig ki lehet választani egy restrikciós enzimet, amely a bakteriális DNS-t meglehetősen kis számú fragmensre hasítja, amelyből aztán kiválaszthatja a kívántakat. Szerencsés esetben akár egy olyan enzimet is fel lehet venni, amely egy, pontosan meghatározott helyen hasítja a DNS-t.
De a restrisztázok specifitása teljesen elégtelen a növények és állatok genomjával való munkához. Az ilyen genomok sok rövid nukleotidszekvenciát tartalmaznak, amelyeket a restrikciós enzimek felismernek, így lehetetlenné válik a célzott hatás egy adott helyen. Mindeközben a biotechnológia és a fundamentális orvoslás számos legfontosabb problémájának megoldásához hatékony és precíz eszközökre volt szükség a magasabb rendű élőlények, köztük az ember genomjának egyes DNS-régióinak ponthatás végrehajtásához.
Először kimérák voltak
Az első kísérletek komplex genomok szerkesztésére szolgáló módszerek megalkotására olyan "mesterséges enzimek" megalkotásához kapcsolódnak oligonukleotidok (rövid nukleotidszekvenciák) formájában, amelyek szelektíven kötődhetnének a cél-DNS szerkezetének bizonyos szekvenciáihoz, és olyan kémiai csoportokat hordoznának. a DNS felhasadásáról (Knorre, Vlasov, 1985). A DNS-hasítás hatékony módszereit azonban még nem alkották meg ezen az alapon.
Kiméra nukleázok, komplex fehérjék, amelyek két szerkezeti egységet tartalmaznak, amelyek közül az egyik a DNS hasítását katalizálja, a másik pedig képes szelektíven kötődni a célmolekulában lévő egyes nukleotidszekvenciákhoz, és a nukleáz hatását erre a helyre irányítja. legyen egy igazán működő megközelítés. Az ilyen kiméra nukleázok közvetlenül a sejtben "termelhetők": ehhez megfelelő, génmanipulált konstrukciókat (vektorokat) juttatnak be, amelyek nukleázokat kódolnak. Az ilyen vektorokat nukleáris lokalizációs jellel látják el, egy olyan fehérjeszerkezettel, amely biztosítja a konstrukciónak a sejtmagba való bejutását a genomiális DNS-hez.
A kiméra nukleázok közül az elsők a cink-ujj nukleázok, amelyek címzési szerkezetként az úgynevezett „cink ujjakat” foglalják magukban. Ez utóbbiak fehérjedomének (a fehérje harmadlagos szerkezetének meglehetősen stabil és független elemei), amelyek cinkmolekulát tartalmaznak, és alakjukban valóban ujjra emlékeztetnek (Kim et al., 1996). Mindegyik "cink ujj" képes "felismerni" és specifikusan kötődni egy specifikus három nukleotidból álló DNS-szekvenciához.
El kell mondani, hogy a cink ujj domének az emberi transzkripciós faktorokban találhatók, olyan fehérjékben, amelyek a DNS-templáttal szabályozzák az RNS szintézis folyamatát. Mesterséges nukleázok létrehozásakor lehetőség van "cink ujjakból" álló lánc létrehozására, amely felismeri a DNS egy bizonyos szakaszát. Ha egy ilyen lánc elég hosszú, akkor viszonylag hosszú DNS-szekvenciákat képes felismerni, amelyek számos trinukleotid-fragmensből állnak. Ez azt jelenti, hogy a nagy komplex genomok összetételében a meghatározott területeken célzott hatás érhető el.
A "cink ujjak" módszere azonban komoly hátrányokat is feltárt: egyrészt a trinukleotid ismétlődések nem egészen szigorú felismerése, ami a DNS-hasítások észrevehető számához vezet a "nem célterületeken". Másodszor, a módszer nagyon munkaigényesnek és költségesnek bizonyult, mivel minden DNS-szekvenciához meg kell alkotni a saját, optimalizált cink-ujj-nukleáz fehérjeszerkezetét. Ezért a "cink ujjak" rendszert nem alkalmazták széles körben.
Mivel a DNS „felismerési” mechanizmus ebben az esetben egyértelmű és egyszerű (egy nukleotidot egy fehérjedomén ismer fel), viszonylag egyszerű feladat egy olyan konstrukció előállítása, amely specifikusan felismeri a kutatónak szükséges nukleotidszekvenciát. Egy ilyen vezetőszerkezetet DNS-hasító enzimmel kombinálva (rendszerint a FokI-t, a restrikciós enzim katalitikus doménjét használják erre a célra), nagy hatásspecifitású rendszert kapunk.
Itt meg kell jegyezni, hogy ennek az enzimnek két alegységére van szükség a DNS-molekula FokI általi sikeres vágásához. Ezért minden FokI-et tartalmazó kiméra nukleáz párban működik: mindegyik felismeri a saját specifikus helyét a DNS-molekula különböző szálain. Ezeket a célhelyeket úgy választjuk meg, hogy kis (10-20 nukleotid) távolságban legyenek, ami elegendő a FokI domének dimerizációjához, ami katalitikusan aktív szerkezet kialakulását eredményezi. Mivel az ilyen bináris nukleáz blokkjai egymástól függetlenül kötődnek a DNS-hez, a DNS hasítás pontossága megnő, és a „nem cél” szekvenciákra gyakorolt hatás minimális.
Bakteriális know-how
A TALEN mesterséges nukleázok segítségével elméletileg lehetséges volt a genom bármely részébe kettős száltörést bevezetni. A neves Nature Methods folyóirat 2011-ben a genomikai mérnöki módszereket, mindenekelőtt a TALEN-ek használatát az "Év Módszerének" választotta, mivel rendkívül sokféle alkalmazási lehetőséget kínálnak az alap- és alkalmazott tudományok legkülönbözőbb területein, a funkcionálistól kezdve. genomikától és fejlődésbiológiától a mezőgazdasági biotechnológiáig.
Azonban a 2012-2013 ezen a területen valóban forradalmi áttörés következett be: kifejlesztettek egy új géntechnológiai módszert, a CRISPR/Cas-t, amely alapvetően új lehetőségeket nyitott meg a magasabb rendű élőlények genom szintű manipulációiban (Kong et al., 2013). Ez a módszer rendkívül egyszerű, pontos hatást biztosít a meghatározott DNS-régiókra, és szinte minden modern molekuláris biológiai laboratóriumban alkalmazható.
A kiméra nukleázokkal ellentétben a CRISPR/Cas-ban a DNS-t felismerő struktúrák nem fehérjék, hanem rövid RNS-ek. Egy ilyen rendszer létrehozásának ötlete a baktériumok által a patogén vírusok (bakteriofágok) elleni védekezésre használt mechanizmusok tanulmányozása során született meg. Konkrétan a baktériumok sajátos "immun" reakcióiról beszélünk egy bizonyos bakteriofág behatolására, ami a genomiális DNS szelektív hasításában fejeződik ki.
Ennek a mechanizmusnak a működését a bakteriális genom speciális szakaszai - CRISPR lókuszok (a Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats - rövid palindrom ismétlődésekből rendszeresen csoportokba rendezve) biztosítják. Ahogy a név is sugallja, ez a lókusz a bakteriális DNS standard ismétlődő, nem kódoló szekvenciáiból áll, és ezeket az ismétlődéseket távtartók, az idegen (vírus vagy plazmid) DNS rövid fragmentumai választják el. Utóbbiak azután épülnek be a bakteriális genomba, hogy a baktériumsejtbe került bakteriofág DNS-e rekombinálódik genomjával. A távtartók összetétele és elrendezése jelzi a különféle vírusok "támadásainak" számát, amelyeket maga a baktériumsejt és (vagy) szülői generációja sikeresen túlélt.
Hogyan működik? Amikor egy általa már „ismert” vírus újra behatol egy baktériumsejtbe, megtörténik a CRISPR lókuszban kódolt kiterjesztett primer RNS szintézise. Ennek az elsődleges DNS-nek az „érése” eredményeként számos rövid fragmentum (crRNS) képződik, amelyek mindegyike egy távtartónak megfelelő specifikus régióból és a bakteriális DNS palindrom ismétlődéseinek megfelelő univerzális régiókból áll. A már említett Cas fehérjék vonzásáért a bakteriális DNS a felelős, a távtartó pedig irányító szerepet tölt be: a vírus DNS egy bizonyos komplementer szakaszához kötődik, majd ezt követően a Cas fehérjék elvágják, biztosítva ezzel a bakteriofág pusztulását. Magas specifitásának és gyors „konfigurálhatóságának” köszönhetően a CRISPR/Cas rendszer nagyon hatékonyan működik, megbízható védelmet biztosítva a baktériumoknak és utódainak a kórokozók ellen.
A mai napig számos különböző típusú CRISPR védelmi rendszert írtak le részletesen, amelyek különböző baktériumok sejtjeiben működnek. A „legnépszerűbb” a baktériumban található II-A típusú CRISPR/Cas rendszer volt Streptococcus pyogenes, amely három crRNS-t kódoló génből, transzaktiváló RNS-ből (tracrRNS) és a Cas9 fehérjéből áll. E rendszer alapján univerzális genetikai konstrukciókat hoztak létre, amelyek a mesterséges "genomszerkesztő" CRISPR/Cas elemeit kódolják.
A rendszer egy egyszerűsített változata is elkészült, amely a Cas9 fehérje és egyetlen vezető RNS komplexeként funkcionál, amely egy CRISPR transzaktiváló RNS-ből és egy rövid „érett” crRNS-ből áll. A vezető szekvencia felismeri a cél DNS-régiót és komplementeren kötődik hozzá, míg a Cas9 a megfelelő helyen vágja el a DNS-t.
A CRISPR/Cas rendszer használatával lehetőség nyílik mindenféle genommódosítás végrehajtására: pontmutációk bevezetésére, bizonyos helyekre új gének beszúrására, vagy éppen ellenkezőleg, nukleotidszekvenciák nagy szakaszainak eltávolítására, egyes genetikai elemek és génfragmentumok javítására vagy cseréjére. .
Technológiailag a CRISPR/Cas rendszert alkalmazó genomiális tervezés stratégiája a következő lépéseket tartalmazza: a célszekvencia kiválasztása és a szükséges hatás típusának meghatározása; gén-célzott konstrukció létrehozása és eljuttatása a sejtmagba; az érintett genomrégió elemzése.
A CRISPR rendszer segítségével tenyészetben és élő szervezetekben termesztett, genetikailag módosított sejtek is nyerhetők. Az első esetben plazmidokat vagy vírusvektorokat juttatnak a sejtekbe, amelyek a CRISPR/Cas rendszer elemeinek magas szintű és stabil szintézisét biztosítják. A második esetben a már „kész” crRNS-t és mRNS-t, amelyekből a Cas9 fehérje szintézise megtörténik, mikroinjekcióval juttatják be az egysejtű állatembriókba. A géntechnológiával módosított növények előállításához, amelyek sejtjei erős héjjal rendelkeznek, tenyészetben növesztett protoplasztokat (külső héj nélküli növényi sejteket) és CRISPR/Cas elemeket kódoló plazmidokat használnak. A növényeknél alkalmazott másik megközelítés az agrobaktériumok, a természetes "génmérnökök" alkalmazása, amelyek speciális plazmidot hordoznak.
Jelen és jövő
Egyszerűségének, hatékonyságának és széleskörű képességeinek köszönhetően a CRISPR/Cas rendszer már rövid időn belül alkalmazásra talált a fundamentális és alkalmazott biológia, biotechnológia és orvostudomány különböző területein.
Az állati és növényi sejtek genomjának különböző elemeinek módosításával és a következmények tanulmányozásával a tudósok az egyes gének egyes sejtek és az egész szervezet működésében betöltött szerepét vizsgálhatják. Számos mutáns laboratóriumi állatot (egerek, patkányok, békák, halak) sikerült már előállítani a CRISPR/Cas rendszer segítségével. Mindezek a modellszervezetek új távlatokat nyitnak a fejlődésbiológia, az immunológia, valamint az emberi és állati betegségek kutatása számára.
A CRISPR/Cas rendszerkomplexum egyedülálló képessége, hogy szelektíven kötődjön bizonyos DNS-régiókhoz, lehetővé tette génaktivitás-szabályozók kifejlesztését az alapján. Ennek érdekében a rendszer tartalmaz egy katalitikusan inaktív mutáns Cas9 fehérjét, amelyhez olyan fehérjék kapcsolhatók, amelyek aktiválják vagy elnyomják a gének működését irányító promóterek funkcióit. Amikor egy ilyen komplex kötődik a cél-DNS-hez, a célgén működése elnyomható vagy stimulálható.
Sőt, a CRISPR/Cas rendszer használatakor lehetőség nyílik a sejtekbe több, a genom különböző részeit megcélzó genetikai konstrukció egyidejű bejuttatására. Ez lehetővé teszi több gén munkájának egyidejű befolyásolását annak érdekében, hogy feltárja a köztük lévő kapcsolatot és a normális és kóros életfolyamatokban való részvételüket. Ily módon lehetőség nyílik például a rákos daganatok kemoterápiával szembeni rezisztenciájának kialakulásáért felelős gének mutációinak meghatározására.
A modern biomedicina egyik legfontosabb feladata új gyógyszerek kutatására és preklinikai vizsgálatára szolgáló sejtmodellek létrehozása. Azáltal, hogy célzott módosításokat viszünk be az emberi őssejt genomjába, olyan sejtvonalakat kapunk, amelyek bizonyos gének működési zavarai által okozott örökletes betegségek modelljei. Az ilyen sejtvonalak valójában korlátlan forrást jelentenek a „betegek in vitro” számára, amelyeken több tízezer különböző kémiai vegyületet – potenciális gyógyszert – lehet tesztelni.
A CRISPR/Cas-hoz is nagy reményeket fűznek a génterápia fejlesztésével kapcsolatban. A sok éves kiterjedt kutatás ellenére még nem sikerült elfogadható módszereket kidolgozni a hibás gének sejtekbe való bejuttatására. A kudarcok fő oka az "extra" DNS-t tartalmazó (bakteriális vagy vírusos) genetikai konstrukciók alkalmazása, ráadásul ezek ellenőrizhetetlenül integrálódtak a genom tetszőleges régióiba. Mindez különféle zavarokhoz vezetett a genetikai apparátus működésében, beleértve a sejtek rosszindulatú átalakulását. A CRISPR/Cas azonban lehetővé teszi a gének sebészi pontossággal történő bejuttatását a genomba, így a génterápia biztonságos.
Sőt, ezzel a módszerrel nem lehet kívülről „idegeneket” bevezetni, hanem saját genetikai apparátust szerkeszteni, a „saját” szabályozórendszerek fenntartása mellett. Így már lehetséges volt egy abnormális gén szerkesztése egy cisztás fibrózisban szenvedő beteg őssejtjeiben (Schwank et al., 2013). Az ilyen "javított" genommal rendelkező sejteket vissza lehet ültetni a páciens szervezetébe, ahol a beteg sejteket pótolják, és pótolják elvesztett funkciójukat.
A modern biotechnológia és biomedicina legfontosabb, genomszerkesztési technológiák fejlesztését igénylő feladatai a következők:új, értékes tulajdonságokkal és jellemzőkkel rendelkező növények és állatok létrehozása (hozam, kedvezőtlen környezeti feltételekkel, kártevőkkel és kórokozókkal szembeni ellenállás);
mutáns modellállatok beszerzése emberi betegségek tanulmányozására;
génterápiás módszerek fejlesztése, tenyésztett emberi őssejtek genetikai mutációinak korrekciója;
sejtmodellek létrehozása új gyógyszerek kutatásához és preklinikai vizsgálatához
A CRISPR/Cas módszer sejttechnológiákkal kombinálva alapvető lehetőséget kínál arra, hogy az embereket radikálisan megszabadítsák az olyan genetikai betegségektől, mint a diabetes mellitus, a Huntington-kór, az izomdisztrófiák stb. A genetikai beavatkozás a kapott embriók szintjén is elvégezhető az in vitro megtermékenyítés során, amiből olyan szervezetet lehet növeszteni, amelynek minden sejtje módosított genommal rendelkezik. Az ilyen technológiák kifejlesztésének egyetlen akadálya az etikai problémák: minden szükséges felszerelés már létezik, és azokat laboratóriumi állatokon tesztelték. Például lehetséges volt egészséges egereket növeszteni embrionális sejtekből, amelyekben a szürkehályog kialakulásáért felelős hibás gént korrigálták. Ezek az egyedek egészséges utódokat hoztak létre (Wu et al., 2013).
A modern terápiák sajnos nem képesek hatni a vírus DNS-ére, amely az emberi DNS része. A CRISPR mechanizmus szerint működő rendszerek a jövőben lehetővé tehetik az emberi genomba integrálódó vírusok által okozott krónikus betegségek (hepatitis B, herpesz, HIV stb.) radikális gyógyítását. Így van egy ismert eset, amikor az úgynevezett "berlini beteg", T. Brown meggyógyult az AIDS-ből egy olyan donor vér-őssejtjei transzplantációja eredményeként, amely a HIV-re "immunitás" mutációt hordozott. A CRISPR/Cas technológiával lehetőség van ebbe a génbe mutációt bevinni olyan sejtekben, amelyek azután átültethetők egy fertőzött személy testébe.
A modern biotechnológia egyik legfontosabb feladata új állatfajták, valamint magas hozamú és kedvezőtlen körülményeknek ellenálló növénykultúrák létrehozása. A CRISPR/Cas módszer biotechnológiai alkalmazásának fő célja olyan géntechnológiával módosított állatok és kultúrnövények létrehozása, amelyek új értékes tulajdonságokkal rendelkeznének. A rendszer segítségével a búza és a dohány genomjában már precíz módosításokat végeztek, baktériumokkal szemben ellenálló rizsfajtákat kaptak. Xanthomonas, bakteriális rothadást okoz, ami nagy gazdasági károkat okoz a mezőgazdaságban (Chen és Gao, 2013).
A CRISPR/Cas rendszer másik érdekes biotechnológiai alkalmazási területe az emberi fehérjék szintetizálására képes állati vagy növényi vonalak előállítása, például a diabetes mellitusban szenvedő betegek számára szükséges inzulin, vagy az albumin, amelyet a cukorbetegségben használnak. vérzéses sokk, égési sérülések és májcirrózis kezelése. Jelenleg az albumint emberi vérplazmából nyerik - nagyon korlátozott forrásból, de a gyógyszer iránti kereslet folyamatosan növekszik, és ma évi 500 tonna. Genomikus mérnöki módszerek segítségével a humán albumin gén már bekerült a rizs és a szarvasmarha genomjába (Ő et al., 2011; Moghaddassi et al., 2014). Egy ilyen fehérje izolálható növényi és állati szövetekből, ahol szintetizálták, és tisztítás után gyógyászati célokra felhasználható.
A CRISPR/Cas rendszert kétségtelenül továbbfejlesztik a közeljövőben: várható a fehérje katalitikus komponens egyszerűsítése, a rendszer szelektivitásának növekedése, valamint a különböző sejttípusokba és egészbe történő bejuttatás hatékonyabb módjai. organizmusok. Már olyan adatok is érkeztek, amelyek arra utalnak, hogy a CRISPR rendszer alapján nem csak a DNS-re, hanem az RNS-re is lehetőség nyílik olyan célzott hatás létrehozására, amely új lehetőségeket nyit meg a génaktivitás szabályozásában és a vírusfertőzések leküzdésében.
Bár a CRISPR/Cas genomszerkesztő rendszert csak 2012-ben hozták létre, a fejlett országok számos laboratóriumában és vállalatában már alkalmazzák. Több száz kutatási eredményt publikáltak ezzel a technológiával, több tucat sikeres kísérletet írtak le élesztőgombák, rágcsálók, rovarok, növények és emberi sejtek genomjának szerkesztésére.
A rendszerelemeket kész készletek formájában a Thermo Fisherrel (USA) nemrég egyesült Life Technologies állítja elő, és ezek a kutatók rendelkezésére állnak. A nagy gyógyszercégek, mint például a Takeda, a CRISPR technológiát használják genetikailag módosított őssejtek, betegségek sejtmodelljei tárolására.
Annak ellenére, hogy ezt a technológiát a világ nagy tudományos központjaiban aktívan használják, Oroszországban a CRISPR/Cas-t csak néhány kutatóközpontban használják, köztük a Novoszibirszki Akadémián. Ma az Orosz Tudományos Akadémia Szibériai Kirendeltsége Citológiai és Genetikai Intézetének Fejlődési Epigenetikai Laboratóriumában, a Keringési Patológiai Intézet Molekuláris és Sejtgyógyászati Laboratóriumában alkalmazzák a TALEN-eket és a CRISPR/Cas technológiákat. EN Meshalkin akadémikus és az Orosz Tudományos Akadémia Szibériai Fiókjának Kémiai Biológiai és Alapvető Orvostudományi Intézetének Őssejt-laboratóriumában a mutációk emberi őssejtekbe történő bevezetésével kapcsolatos munkákban, különösen a sejtmodellek létrehozásában. amiotróf laterális szklerózis, Alzheimer-kór, Parkinson-kór és hosszú intervallumú szindróma Qt.
A TALEN és CRISPR/Cas felhasználásával végzett teljes körű kutatáshoz azonban szükség van egy sejttechnológiai konzorcium létrehozására az Orosz Orvostudományi Akadémia speciális kutatóintézetein alapuló vezető szakemberek bevonásával: kardiológia, immunológia, neurológia, onkológia stb. új orvosbiológiai technológiák és csúcstechnológiás gyógyszeripar fejlesztése érdekében - kiemelt területek az ország tudományos-technikai potenciáljának fejlesztéséhez.
Jelenleg fejlesztés alatt áll az Emberi Betegségek Sejtmodelljei Biobank projektje, melynek alapját különféle örökletes és szerzett betegségekben szenvedők közönséges szomatikus sejtjeiből nyert indukált pluripotens őssejtvonalak képezik. Ezen kívül a Biobank tartalmazni fogja az emberi örökletes betegségek sejtmodelljeit is – a TALEN-ek és a CRISPR/Cas genomtechnológiai módszerekkel előállított sejtvonalakat.
A sejtvonalakat és tenyészeteket folyékony nitrogénben tárolják, amelyben évtizedekig életképesek maradhatnak, és szükség szerint felhasználhatók. A biobankban tárolt összes sejttenyészetet és sejtvonalat részletesen jellemzik: mindegyikhez „útlevelet” állítanak ki, amely információkat tartalmaz annak eredetéről és jellemzőiről. Az ilyen sejtvonalakat mind a betegségek kialakulásának mechanizmusaival kapcsolatos alapkutatásokat végző tudományos intézmények, mind az új gyógyszerek felkutatásában, fejlesztésében, előállításában és tesztelésében részt vevő magáncégek rendelkezésére bocsáthatják.
Irodalom
Vlasov VV et al. Az egészséget kiegészítő. Az antiszensz technológiák múltja, jelene és jövője // TUDOMÁNY első kézből. 2014. 1. szám (55). 38-50.
Knorre D. G., Vlasov V. V. // Advances in Chemistry. 1985. V. 54, No. 9. S.1420-1447.
Medvegyev S.P. Az öröklődés szerkesztése // TUDOMÁNY első kézből. 2014, 1. szám (55). 10-14.o.
Сong L., Ran F.A., Cox D. et al. Multiplex genom tervezés CRISPR/Cas rendszerek használatával // Tudomány. 2013, 339.
P. 819-823.
Kim Y. G., Cha J., Chandrasegaran, S. (1996). Hibrid restrikciós enzimek: cink ujj fúziók a Fok I hasítási doménnel. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 1156-1160.
Moghaddassi S., Eyestone W., püspök C.E. (2014). A szarvasmarha genom TALEN által közvetített módosítása a humán szérumalbumin nagyléptékű előállításához. PLoS One 9, e89631.
Schwank, G., Koo, B. K., Sasselli, V. et al. (2013). A CFTR funkcionális javítása CRISPR/Cas9 segítségével cisztás fibrózisos betegek bél őssejt-organoidjaiban. Cell Stem Cell 13, 653-658.
Wu, Y., Liang, D., Wang, Y., Bai, M. et al. Genetikai betegség korrekciója egérben a CRISPR-Cas9 használatával. Cell Stem Cell 13, 659-662.
Az első transzgenikus növényeket (mikroorganizmusokból származó géneket tartalmazó dohánynövények) 1983-ban szerezték be. A transzgenikus növények (vírusfertőzéssel szemben rezisztens dohánynövények) első sikeres szabadföldi kísérleteit már 1986-ban végezték el az USA-ban.
Az összes szükséges toxicitási, allergenitási, mutagenitási stb. vizsgálat elvégzése után. Az első transzgénikus termékek 1994-ben kerültek kereskedelmi forgalomba az Egyesült Államokban. Ezek a Calgen késleltetett érésű Flavr Savr paradicsom és a Monsanto herbicid-rezisztens szójababok voltak. A biotechnológiai cégek már 1-2 év után számos génmódosított növényt hoztak forgalomba: paradicsom, kukorica, burgonya, dohány, szójabab, repce, velő, retek, gyapot.
Jelenleg világszerte több száz kereskedelmi cég vesz részt géntechnológiával módosított növények beszerzésében és tesztelésében, több mint százmilliárd dollár össztőkével. 1999-ben mintegy 40 millió hektár összterületen ültettek transzgénikus növényeket, ami nagyobb, mint egy olyan ország, mint az Egyesült Királyság. Az Egyesült Államokban a géntechnológiával módosított növények (GM Crops) a kukorica- és szójababtermés körülbelül 50%-át, a gyapotnövények több mint 30-40%-át teszik ki. Ez arra utal, hogy a génmanipulált növényi biotechnológia már az élelmiszerek és más hasznos termékek előállításának fontos iparágává vált, jelentős humánerőforrást és pénzügyi áramlásokat vonzva. A következő években a termesztett növények transzgénikus formái által elfoglalt terület további gyors növekedése várható.
A gyakorlati felhasználásra jóváhagyott transzgenikus növények első hulláma további rezisztenciagéneket tartalmazott (betegségekkel, gyomirtókkal, kártevőkkel, tárolás közbeni romlással és stresszekkel szemben).
A növényi géntechnológia fejlődésének jelenlegi szakaszát „metabolikus tervezésnek” nevezik. Ugyanakkor nem annyira a növény egyes meglévő tulajdonságainak javítása a feladat, mint a hagyományos nemesítésben, hanem az, hogy megtanítsuk a növényt teljesen új, a gyógyászatban, vegyiparban és egyéb területeken használt vegyületek előállítására. Ezek a vegyületek lehetnek például speciális zsírsavak, hasznos fehérjék magas esszenciális aminosav tartalommal, módosított poliszacharidok, ehető vakcinák, antitestek, interferonok és más „gyógyszer” fehérjék, új környezetbarát polimerek és még sok más. A transzgénikus növények alkalmazása lehetővé teszi az ilyen anyagok nagyüzemi és olcsó előállítását, és ezáltal szélesebb körű fogyasztásra való alkalmassá tételét.
A növényi tárolófehérjék minőségének javítása
A főbb tenyésztett fajok raktározási fehérjéit szorosan kapcsolódó gének családja kódolja. A magtároló fehérjék felhalmozódása összetett bioszintetikus folyamat. D. Kemp és T. Hall hajtotta végre 1983-ban az Egyesült Államokban az első géntechnológiai kísérletet, amellyel egy növény tulajdonságait egy másikból raktározó fehérjegén bejuttatásával javították. A babfazeolin gént Ti plazmid segítségével vittük át a napraforgó genomjába. Ennek a kísérletnek az eredménye csak egy kiméra növény, az úgynevezett szanbin. Napraforgósejtekben immunológiailag rokon phaseolin polipeptideket találtak, amelyek megerősítették a különböző családokba tartozó növények közötti géntranszfer tényét.
Később a phaseolin gén átkerült a dohánysejtekbe: a regenerált növényekben a gén minden szövetben kifejeződött, bár kis mennyiségben. A phaseolin gén nem specifikus expressziója, akárcsak a napraforgósejtekbe való átvitele esetében, nagyon különbözik e gén expressziójától az érett bab sziklevelekben, ahol a fazeolin a teljes fehérje 25-50%-át tette ki. Ez a tény azt jelzi, hogy a kiméra növények építése során meg kell őrizni ennek a génnek a többi szabályozó jelét, valamint a génexpresszió szabályozásának fontosságát a növényi ontogén folyamatban.
A kukorica tároló fehérjét, a zeint kódoló gén a T-DNS-be való integrálódása után a napraforgó genomjába az alábbiak szerint került át. A zein gént tartalmazó Ti plazmidokat tartalmazó Agrobacterium törzseket napraforgó szárban daganatok indukálására használtuk. A kapott daganatok némelyike kukoricagénekből szintetizált mRNS-t tartalmazott, ami okot ad arra, hogy ezeket az eredményeket az egyszikű gén kétszikűben történő transzkripciójának első bizonyítékának tekintsük. A zein fehérje jelenlétét azonban a napraforgó szöveteiben nem mutatták ki.
A géntechnológia reálisabb feladata a fehérjék aminosav-összetételének javítása. Mint ismeretes, a legtöbb gabonafélék raktározó fehérjéjében hiányzik a lizin, a treonin, a triptofán, a hüvelyesekben a metionin és a cisztein. További mennyiségű hiányos aminosav bevitele ezekbe a fehérjékbe megszüntetheti az aminosav-egyensúly felborulását. A hagyományos nemesítési módszerekkel sikerült jelentősen növelni a lizin-tartalmat a gabonafélék raktározó fehérjéiben. Mindezekben az esetekben a prolaminok (a gabonafélék alkoholban oldódó raktárfehérjéi) egy részét más, sok lizint tartalmazó fehérjékkel helyettesítették. Az ilyen növényekben azonban csökkent a szemcseméret és csökkent a terméshozam. Nyilvánvalóan a prolaminok szükségesek a normál szemtermés kialakulásához, és más fehérjékkel való helyettesítésük negatívan befolyásolja a termést. E körülmény ismeretében a gabonatároló fehérje minőségének javításához olyan fehérjére van szükség, amely nem csak magas lizin- és treonintartalmú, hanem a szemtermés során a prolaminok egy részét teljes mértékben képes pótolni.
A növények állati fehérjéket is termelhetnek. Így az Arabidopsis thaliana és Brassica napus növények genomjába az Arabidopsis 25-protein gén egy részéből és az enkefalin neuropeptidet kódoló részből álló kiméra gén inszerciója a kiméra fehérje szintézisét eredményezte 200 ng/1 mennyiségig. g mag. Két strukturális fehérjedomént kapcsoltak össze a tripszin által felismert szekvenciával, ami lehetővé tette a tiszta enkefalin további egyszerű izolálását.
Egy másik kísérletben transzgenikus növények keresztezése után, amelyek közül az egyikbe a gamma alegység génjét, a másodikba pedig az immunglobulin kappa alegységének génjét helyezték be, mindkét lánc expresszióját sikerült elérni az utódokban. Ennek eredményeként a növényben antitestek képződtek, amelyek a teljes levélfehérje 1,3%-át tették ki. Azt is kimutatták, hogy teljesen működőképes szekréciós monoklonális immunglobulinok összeállíthatók dohánynövényekben. A szekréciós immunglobulinok általában az emberek és állatok szájüregébe és gyomrába választódnak ki, és a bélfertőzések első gátjaként szolgálnak. A fent említett munkában monoklonális antitesteket termeltek olyan növényekben, amelyek specifikusak a Streptococcus mutansra, a fogszuvasodást okozó baktériumokra. Feltételezik, hogy a transzgénikus növények által termelt ilyen monoklonális antitestek alapján egy valóban fogszuvasodás elleni fogkrémet lehet létrehozni. Egyéb orvosi jelentőségű állati fehérjék közül kimutatták a humán β-interferon termelődését növényekben.
Megközelítéseket is kidolgoztak a bakteriális antigének növényekben való kinyerésére és vakcinaként való felhasználására. A nem toxikus kolera β-toxin alegység burgonyát expresszáló oligomerjeit kaptuk. Ezeket a transzgenikus növényeket olcsó koleravakcina előállítására lehetne használni.
Zsírok
A zsírsavak, a növényi olajok fő összetevői, a legfontosabb alapanyagok különféle vegyszerek előállításához. Szerkezetükben szénláncokról van szó, amelyek hosszuktól és a szénkötések telítettségi fokától függően eltérő fizikai-kémiai tulajdonságokkal rendelkeznek. 1995-ben befejeződött a kísérleti tesztelés, és engedélyt szereztek az Egyesült Államok szövetségi hatóságaitól olyan transzgénikus repcenövények termesztésére és kereskedelmi felhasználására, amelyek módosított összetételű növényi olajat tartalmaznak, beleértve a hagyományos 16 és 18 tagú zsírsavakat is. 45%-ra 12 tagú zsírsav - díjazott. Ezt az anyagot széles körben használják mosóporok, samponok és kozmetikumok gyártásához.
A kísérleti munka abból állt, hogy a specifikus tioészteráz gént az Umbellularia califomica növényből klónozták, ahol a magzsír lauráttartalma elérte a 70%-ot. Ennek az enzimnek a génjének szerkezeti része, a magképződés korai szakaszára specifikus fehérjegén promoter-terminátorának szabályozása alatt, beépült a repce és az Arabidopsis genomjába, ami a magképződés korai szakaszára specifikus gén promóter-terminátorának szabályozása alatt került beépülésre a repce és az Arabidopsis genomjába, ami a magképződés korai szakaszára specifikus fehérje-terminátor irányítása alatt került beépítésre laurát e növények olajában.
A zsírsavak összetételének megváltoztatásával kapcsolatos egyéb projektek között említhetők a növényi olajok telítetlen zsírsavtartalmának növelésére vagy csökkentésére irányuló munkák. Érdekesek a petroselinsavval, az olajsav izomerjével végzett kísérletek, ahol a kettős kötés a hatodik széntag mögött található. Ez a zsírsav a korianderolaj összetételének része, és meghatározza annak magasabb olvadáspontját (33 °C), míg olajsav jelenlétében az olvadáspont csak 12 °C. Feltételezik, hogy a petroselinsav szintézisét meghatározó gének növényekbe – növényi olajtermelőkbe – történő átvitele után lehetőség nyílik telítetlen zsírsavat tartalmazó diétás margarin előállítására. Ezen túlmenően ózonos oxidációval petroszelinsavból nagyon könnyű laurátot nyerni. A zsírsavak biokémiai szintézisének sajátosságainak további tanulmányozása nyilvánvalóan lehetővé teszi a szintézis szabályozását, hogy különböző hosszúságú és telítettségi fokú zsírsavakat kapjunk, ami jelentősen megváltoztatja a mosószerek, kozmetikumok, édességek előállítását. , keményítők, kenőanyagok, gyógyszerek, polimerek. , dízel üzemanyag és még sok más, ami a szénhidrogén nyersanyagok felhasználásával kapcsolatos.
Poliszacharidok
Folyamatban van a transzgénikus burgonyanövények és más keményítőt felhalmozó növények létrehozása, amelyekben ez az anyag főleg amilopektin, azaz a keményítő elágazó formája, vagy főleg csak amilóz, azaz lineáris formában lesz jelen. keményítő formái. Az amilopektin vizes oldata folyékonyabb és átlátszóbb, mint az amilózáé, amely vízzel kölcsönhatásba lépve merev gélt képez. Így például a főként amilopektinből álló keményítő valószínűleg kereslet lesz a különféle táplálkozási keverékek gyártóinak piacán, ahol jelenleg módosított keményítőt használnak töltőanyagként. A plasztidok és mitokondriumok genomja szintén genetikai módosuláson eshet át. Az ilyen rendszerek jelentősen növelhetik a termék tartalmát a transzgénikus anyagban.
Herbicidrezisztens növények létrehozása
Az új, intenzív mezőgazdasági technológiákban nagyon széles körben alkalmazzák a gyomirtó szereket. Ehhez kapcsolódik. hogy a korábbi környezetre veszélyes, széles spektrumú, az emlősökre mérgező, a külső környezetben sokáig megmaradó gyomirtó szereket új, fejlettebb és biztonságosabb vegyületek váltják fel. Van azonban egy hátrányuk - nemcsak a gyomok, hanem a kultúrnövények növekedését is gátolják.Az olyan rendkívül hatékony gyomirtó szereket, mint a glifozát, az atrazinok, intenzíven tanulmányozzák egyes gyomnövények toleranciájának mechanizmusa érdekében. Így azokon a területeken, ahol az atrazint széles körben használják, sok növényfajban gyakran megjelennek atrazin-rezisztens biotípusok.
A herbicidrezisztencia mechanizmusának vizsgálata az ezzel a tulajdonsággal rendelkező, génmanipulált kultúrnövények előállítása érdekében a következő lépéseket tartalmazza: a herbicidek hatásának biokémiai célpontjainak azonosítása növényi sejtben; az adott gyomirtó szerrel szemben rezisztens szervezetek kiválasztása rezisztenciaforrásként. gének klónozása, kultúrnövényekbe történő bejuttatásuk és működésük tanulmányozása
Négy alapvetően eltérő mechanizmus létezik, amely bizonyos kémiai vegyületekkel, köztük a gyomirtókkal szemben rezisztenciát biztosíthat: szállítás, elimináció, szabályozás és érintkezés. A rezisztencia transzportmechanizmusa abban áll, hogy a herbicid nem tud behatolni a sejtbe. A rezisztencia eliminációs mechanizmusának hatására a sejtbe került anyagok indukálható sejtfaktorok, leggyakrabban lebontó enzimek segítségével elpusztulhatnak, illetve valamilyen módosuláson is átmennek, inaktív, a sejtre ártalmatlan termékek keletkezésével. Szabályozó rezisztencia esetén a herbicid hatására inaktivált fehérje vagy sejtenzim intenzíven szintetizálódik, így megszűnik a kívánt metabolit hiánya a sejtben. A rezisztencia kontaktmechanizmusát a célpont (fehérje vagy enzim) szerkezetének megváltozása biztosítja, melynek kölcsönhatása a gyomirtó szer károsító hatásával függ össze.
Megállapítást nyert, hogy a herbicidrezisztencia tulajdonsága monogén, azaz a tulajdonságot leggyakrabban egyetlen gén határozza meg. Ez nagyban megkönnyíti a rekombináns DNS-technológia alkalmazásának lehetőségét ennek a tulajdonságnak a átvitelére. A különféle gyomirtószer-lebontó és -módosító enzimeket kódoló gének géntechnológiával sikeresen alkalmazhatók herbicidrezisztens növények létrehozására.
A gyomirtószer-rezisztens fajták létrehozásának hagyományos nemesítési módszerei nagyon, időigényesek és nem hatékonyak. A külföldön legelterjedtebb glifozát (kereskedelmi nevén Roundup) gyomirtó szer az 5-enolpiruvilsikimát-3-foszfát-szintáz (EPSP-szintáz) enzimre hatva gátolja a legfontosabb aromás aminosavak szintézisét. Az ezzel a gyomirtó szerrel szembeni rezisztencia ismert esetei vagy ennek az enzimnek a szintézisének emelkedésével (szabályozó mechanizmus), vagy egy glifoszfátra érzéketlen mutáns enzim megjelenésével (kontaktmechanizmus) társulnak. Az EPSP szintáz gént glifoszfát-rezisztens növényekből izoláltuk, és a karfiol mozaikvírus promoter alá helyeztük. A Ti plazmid segítségével ezt a genetikai konstrukciót petúniasejtekbe vittük be. A transzformált sejtekből regenerált növényekben a gén egy példányának jelenlétében 20-40-szer több enzim szintetizálódott, mint az eredeti növényekben, de a glifoszfáttal szembeni rezisztencia csak 10-szeresére nőtt.
Az atrazin az egyik leggyakrabban használt gyomirtó szer a növények kezelésére. Gátolja a fotoszintézist azáltal, hogy a II. fotorendszer egyik fehérjéhez kötődik, és leállítja az elektrontranszportot. A gyomirtószer-rezisztencia ennek a plasztokinon-kötő fehérjének a pontmutációiból adódik (a szerint glicin helyettesíti), aminek következtében elveszti a herbiciddel való kölcsönhatási képességét. Számos esetben lehetőség nyílt a mutáns fehérjegén átvitelére atrazin-érzékeny növényekbe Ti-plazmid segítségével. A növényi kromoszómába integrált rezisztencia gént olyan szignálszekvenciával látták el, amely biztosította a szintetizált fehérje kloroplasztiszokba történő szállítását. A kiméra növények szignifikáns rezisztenciát mutattak az atrazinkoncentrációkkal szemben, amelyek a vad típusú fehérjegént tartalmazó kontrollnövények pusztulását okozták. Egyes növények képesek inaktiválni az atrazint azáltal, hogy a klórmaradékot a glutation-S-transzferáz enzim hasítja. Ugyanez az enzim inaktiválja a triazin sorozat többi rokon herbicidjét is (propazin, szimazin stb.).
Vannak olyan növények, amelyek természetes ellenálló képessége a gyomirtó szerekkel szemben a méregtelenítésen alapul. Így a növények klórszulfuronnal szembeni rezisztenciája összefüggésbe hozható a herbicid molekula dezaktiválásával annak hidroxilezése és a bevitt hidroxilcsoport ezt követő glikozilációja révén. Kórokozókkal és kártevőkkel szemben rezisztens növények kialakulása A növények különböző kórokozókkal szembeni rezisztenciája leggyakrabban összetett többgénes tulajdonság.
Több lókusz egyidejű átvitele még géntechnológiai módszerekkel is nehézkes, nem beszélve a klasszikus szelekciós módszerekről. A másik út egyszerűbb. Ismeretes, hogy az anyagcsere megváltozik a rezisztens növényekben, ha kórokozók támadják meg őket. Olyan vegyületek halmozódnak fel, mint a H2O2, szalicilsav, fitoallexinek. Ezen vegyületek megnövekedett szintje hozzájárul a növény ellenálló képességéhez a kórokozók elleni küzdelemben.
Íme egy példa, amely bizonyítja a szalicilsav szerepét a növények immunválaszában. A szalicilát-hidroláz (ez az enzim lebontja a szalicilsavat) szintézisét szabályozó bakteriális gént tartalmazó transzgénikus dohánynövények nem tudtak immunválaszt kiváltani. Ezért a H2O2 kórokozóra adott válaszként a szalicilsav szintjének vagy a növények termelésének genetikailag módosított megváltoztatása ígéretes lehet rezisztens transzgenikus növények létrehozása szempontjából.
A fitovirológiában a növények vírusfertőzésekkel szembeni keresztrezisztenciájának jelensége széles körben ismert. Ennek a jelenségnek az a lényege, hogy egy növény egyik vírustörzzsel való megfertőzése megakadályozza ezen növények későbbi fertőzését egy másik vírustörzzsel. A vírusfertőzés visszaszorításának molekuláris mechanizmusa még mindig nem tisztázott. Kimutatták, hogy az egyes vírusgének, például a kapszidfehérjék gének bevitele elegendő a növényi immunizáláshoz. Így a dohánymozaikvírus burokfehérjéjének génjét átvitték a dohánysejtekbe, és transzgenikus növényeket kaptak, amelyekben az összes levélfehérje 0,1%-át a vírusfehérje képviseli. E növények jelentős része a vírussal fertőzött állapotban nem mutatta a betegség tüneteit. Lehetséges, hogy a sejtekben szintetizált vírusburok fehérje megakadályozza, hogy a vírus RNS normálisan működjön, és teljes értékű vírusrészecskéket képezzen. Megállapítást nyert, hogy a dohánymozaik vírus, lucerna mozaik vírus, uborka mozaik vírus, burgonya X-vírus kapszid fehérjéjének expressziója a megfelelő transzgenikus növényekben (dohány, paradicsom, burgonya, uborka, paprika) magas szintű növekedést biztosít. védelmet nyújt a későbbi vírusfertőzésekkel szemben. Sőt, a transzformált növényekben nem tapasztalható a termékenység csökkenése, az eredeti példányok és utódaik növekedésében és élettani jellemzőiben nemkívánatos változások. Úgy gondolják, hogy a növények vírusokkal szembeni rezisztenciáját egy speciális vírusellenes fehérje okozza, amely nagyon hasonlít az állati interferonhoz. Úgy tűnik, hogy géntechnológiával lehetséges az ezt a fehérjét kódoló gén expressziójának fokozása annak amplifikálásával vagy erősebb promóterrel való helyettesítésével.
Megjegyzendő, hogy a géntechnológia alkalmazását a növények különféle kórokozó mikroorganizmusokkal szembeni védelmére nagymértékben hátráltatja a növényvédelmi reakciók mechanizmusaira vonatkozó ismeretek hiánya. A rovarirtó szereket a növénytermesztésben a rovarkártevők elleni védekezésre használják. Az emlősökre azonban káros hatással vannak, elpusztítják a jótékony rovarokat, szennyezik a környezetet, az utakat, ráadásul a rovarok gyorsan alkalmazkodnak hozzájuk. Több mint 400 rovarfajról ismert, hogy ellenálló az alkalmazott rovarölő szerekkel szemben. Ezért egyre nagyobb figyelmet kapnak a biológiai védekezési eszközök, amelyek szigorú szelektivitást és a kártevők alkalmazkodásának hiányát biztosítják az alkalmazott biopeszticidhez.
A Bacillus thuringiensis baktériumról régóta ismert, hogy olyan fehérjét termel, amely nagyon mérgező számos rovarfaj számára, ugyanakkor biztonságos az emlősök számára. A fehérjét (delta-endotoxin, CRY protein) a B. thuringiensis különféle törzsei termelik. A toxin kölcsönhatása a receptorokkal szigorúan specifikus, ami megnehezíti a toxin-rovar kombináció kiválasztását. A természetben nagyszámú B. thuringiensis törzset találtak, amelyek toxinjai csak bizonyos rovarfajtákra hatnak. A B. thuringiensis készítményeit évtizedek óta használják rovarok elleni védekezésre szántóföldeken. A toxin és az azt alkotó fehérjék biztonságossága emberek és más emlősök számára teljes mértékben bizonyított. E fehérje génjének beépítése a növényi genomba lehetővé teszi olyan transzgénikus növények előállítását, amelyeket nem esznek meg a rovarok.
A rovarokra gyakorolt hatásukat tekintve a fajspecifikusság mellett a prokarióta delta-toxin gének beépülése a növényi genomba még erős eukarióta promóterek kontrollja mellett sem vezetett magas szintű expresszióhoz. Ez a jelenség feltehetően abból adódik, hogy ezek a bakteriális gének lényegesen több adenin és timin nukleotid bázist tartalmaznak, mint a növényi DNS. Ezt a problémát módosított gének létrehozásával oldották meg, ahol a természetes génből kivágtak és hozzáadtak bizonyos fragmentumokat, miközben megőrizték a delta toxin aktív részeit kódoló doméneket. Például a Colorado burgonyabogárral szemben rezisztens burgonyát ilyen megközelítésekkel állítottak elő. A toxin szintetizálására képes transzgénikus dohánynövényeket kaptak. Az ilyen növények érzéketlenek voltak a Manduca sexta hernyókkal szemben. Ez utóbbi 3 napon belül elpusztult a méregtermelő növényekkel való érintkezés után. A toxinképződés és az ebből eredő rovarokkal szembeni rezisztencia domináns tulajdonságként öröklődött.
Jelenleg a gyapot és a kukorica úgynevezett Bt-növényei (a B. thuringiensis-ből) teszik ki az Egyesült Államokban termesztett növények géntechnológiával módosított növényeinek zömét.
A géntechnológia lehetőségei kapcsán, hogy mikrobiális eredetű toxinon alapuló entomopatogén növényeket tervezzenek, a növényi eredetű toxinok még nagyobb érdeklődésre tartanak számot. A fitotoxinok gátolják a fehérjeszintézist, és védő funkciót töltenek be a mikroorganizmusok és vírusok rovarkártevői ellen. A legjobban tanulmányozott közülük a ricinusban szintetizált ricin, amelynek génjét klónozták, és megállapították a nukleotidszekvenciát. A ricin emlősökre gyakorolt magas toxicitása azonban csak az emberi élelmezésre és állati takarmányozásra nem használt ipari növényekre korlátozza a géntechnológiai munkát. Az American Phytolacca által termelt toxin hatékony a vírusok ellen, és ártalmatlan az állatokra. Hatásmechanizmusa az, hogy saját riboszómáit inaktiválja, amikor különféle kórokozók, köztük fitovírusok kerülnek a sejtekbe. Az érintett sejtek nekrotikussá válnak, ami megakadályozza, hogy a kórokozó elszaporodjon és elterjedjen a növényben. Jelenleg tanulmányok folynak e fehérje génjének tanulmányozására és más növényekbe való átvitelére.
A vírusos megbetegedések elterjedtek a rovarok körében, így a természetes rovarvírusok, amelyek készítményeit vírusirtó szereknek nevezik, a rovarkártevők elleni védekezésre használhatók. A peszticidekkel ellentétben szűk hatásspektrumúak, nem pusztítják el a hasznos rovarokat, gyorsan elpusztulnak a környezetben, és nem veszélyesek a növényekre és az állatokra. A rovarvírusokkal együtt egyes rovarkártevőket megfertőző gombákat biopeszticidként használnak. A jelenleg használt biopeszticidek entomopatogén vírusok és gombák természetes törzsei, de nem kizárt, hogy a jövőben géntechnológiai módszerekkel új, hatékony biopeszticideket hozzanak létre.
Növeli a növény ellenálló képességét a stresszes körülményekkel szemben
A növények nagyon gyakran vannak kitéve különféle kedvezőtlen környezeti tényezőknek: magas és alacsony hőmérséklet, nedvességhiány, talaj szikesedése és környezetszennyezése, bizonyos ásványi anyagok hiánya vagy éppen ellenkezőleg, túlzott mennyisége stb.
Sok ilyen tényező létezik, ezért az ellenük való védekezés módszerei sokfélék - a fiziológiai tulajdonságoktól a káros hatások leküzdését lehetővé tevő szerkezeti adaptációkig.
A növények egy adott stressztényezővel szembeni rezisztenciája sokféle gén hatásának eredménye, így nem szükséges a tolerancia tulajdonságok géntechnológiai módszerekkel történő teljes átadásáról egyik növényfajról a másikra beszélni. Ennek ellenére vannak bizonyos lehetőségek a géntechnológia számára a növények rezisztenciájának javítására. Ez olyan egyedi génekkel végzett munkára vonatkozik, amelyek szabályozzák a növények stresszhelyzetekre adott metabolikus reakcióit, például a prolin túltermelése ozmotikus sokkra válaszul, sótartalom, specifikus fehérjék szintézise hősokkra reagálva stb. További mélyreható tanulmányok fiziológiai, biokémiai és genetikai alapok Egy növény környezeti feltételekre adott válasza kétségtelenül lehetővé teszi géntechnológiai módszerek alkalmazását rezisztens növények létrehozására.
Egyelőre csak a Pseudomonas syringae-vel végzett géntechnológiai manipulációkon alapuló fagyálló növények előállításának közvetett megközelítése figyelhető meg. Ez a növényekkel együtt élõ mikroorganizmus hozzájárul a korai fagyok okozta károsításukhoz, A jelenség mechanizmusa abból adódik, hogy a mikroorganizmus sejtjei egy speciális fehérjét szintetizálnak, amely a külsõ membránban lokalizálódik, és a jégkristályosodás központja. Ismeretes, hogy a jég képződése a vízben olyan anyagoktól függ, amelyek a jégképződés központjaként szolgálhatnak. A növény különböző részein (levelek, szárak, gyökerek) jégkristályok képződését okozó fehérje az egyik fő tényező a korai fagyokra érzékeny növények szöveteinek károsodásáért. Számos, szigorúan ellenőrzött körülmények között végzett kísérlet kimutatta, hogy a steril növényeket nem károsítja a -6 - 8 °C-ig terjedő fagy, míg a megfelelő mikroflórával rendelkező növényekben már -1,5 - 2 °C hőmérsékleten károsodás következett be. Ezeknek a baktériumoknak a mutánsai, azok, amelyek elvesztették a jégkristályok képződését okozó fehérje szintézisét, nem növelték a jégképződés hőmérsékletét, és az ilyen mikroflórával rendelkező növények fagyállóak voltak. Az ilyen baktériumok egy törzse, amelyet burgonyagumókra permeteztek, versenyzett a közönséges baktériumokkal, ami a növények fagyállóságának növekedéséhez vezetett. Lehetséges, hogy az ilyen, géntechnológiai módszerekkel létrehozott és a külső környezet összetevőjeként használt baktériumok a fagyok leküzdését szolgálják.
A biológiai nitrogénkötés hatékonyságának növelése
A molekuláris nitrogén ammóniummá történő redukciójáért felelős enzimet jól tanulmányozták. - nitrogenáz. A nitrogenáz szerkezete minden nitrogénmegkötő szervezetben azonos. A nitrogénkötés során nélkülözhetetlen élettani feltétel a nitrogenáz megóvása az oxigén általi pusztulástól. A legjobban tanulmányozott nitrogénfixálók közül a hüvelyesekkel szimbiózist alkotó rhizobia és a szabadon élő Klebsiella pneumoniae baktérium. Megállapítást nyert, hogy ezekben a baktériumokban 17 gén, az úgynevezett nif gének felelősek a nitrogénkötésért. Mindezek a gének egymáshoz kapcsolódnak, és a hisztidin bioszintézis enzimek gének és a sikiminsav felszívódását meghatározó gének közötti kromoszómán helyezkednek el. Egy gyorsan növekvő rhizobiában a nif gének 200-300 ezer bázispárt tartalmazó megaplazmid formájában léteznek.
A nitrogénfixáló gének közül az elektrontranszportban szerepet játszó fehérjefaktor, a nitrogenáz szerkezetét szabályozó géneket és a szabályozó géneket azonosították. A nitrogénkötő gének szabályozása meglehetősen összetett, ezért a nitrogénkötő funkciónak a baktériumoktól közvetlenül a magasabb rendű növényekhez való genetikailag módosított átvitele jelenleg már nem esik szóba. Amint a kísérletek kimutatták, még a legegyszerűbb eukarióta szervezetben - az élesztőben sem sikerült elérni a nif gének expresszióját, bár azok 50 generáción át fennmaradtak.
Ezek a kísérletek kimutatták, hogy a diazotrófia (nitrogénkötés) kizárólag a prokarióta szervezetekre jellemző, és a nif gének túl bonyolult szerkezetük és a nif régión kívüli gének általi szabályozásuk miatt nem tudták leküzdeni a prokarióták és eukarióták elválasztó gátját. Talán sikeresebb lesz a nif gének Ti plazmidok segítségével kloroplasztiszokba történő átvitele, mivel a kloroplasztiszokban és a prokarióta sejtekben a génexpresszió mechanizmusa hasonló. A nitrogenázt minden esetben védeni kell az oxigén gátló hatásától. Ezenkívül a légköri nitrogén rögzítése nagyon energiaigényes folyamat. Nem valószínű, hogy a nif gének hatása alatt álló növény ilyen radikálisan megváltoztathatja az anyagcseréjét, hogy mindezen feltételeket megteremtse. Bár elképzelhető, hogy a jövőben géntechnológiai módszerekkel gazdaságosabban működő nitrogenáz komplexet lehet létrehozni.
Reálisabb a géntechnológiai módszerek alkalmazása a következő problémák megoldására: a rhizobia hüvelyes növények kolonizáló képességének növelése, a nitrogénkötés és asszimiláció hatékonyságának növelése a genetikai mechanizmus befolyásolásával, új nitrogénmegkötő mikroorganizmusok létrehozása nif gének bejuttatásával. átadva a szimbiózis képességét a hüvelyes növényekről másokra.
A géntechnológia elsődleges feladata a biológiai nitrogénkötés hatékonyságának növelése érdekében fokozott nitrogénkötő és kolonizáló képességű rhizobia törzsek létrehozása. A hüvelyes növények rhizobia általi megtelepedése nagyon lassan megy végbe, csak néhányuk ad gócokat. Ennek az az oka, hogy a rhizobia invázió helye csak egy kis terület a gyökér növekedési pontja és a hozzá legközelebb eső gyökérszőr között, amely a kialakulásának szakaszában van. A gyökér többi része és a növény fejlett gyökérszőrzete érzéketlen a kolonizációra. Egyes esetekben a kialakult csomók nem képesek megkötni a nitrogént, ami sok növényi géntől függ (legalább ötet azonosítottak), különösen két recesszív gén kedvezőtlen kombinációjától.
A hagyományos genetikai és nemesítési módszerekkel nagyobb kolonizáló képességű rhizobia törzseket lehetett előállítani. De tapasztalnak versenyt a helyi törzsekkel a területen. Versenyképességük növelése láthatóan géntechnológiai módszerekkel valósítható meg. A nitrogénkötési folyamat hatékonyságának növelése a génkópiák növelésére épülő géntechnológiai technikákkal, azon gének transzkripciójának fokozásával, amelyek termékei „szűk keresztmetszetet” képeznek a nitrogénfixációs kaszkád mechanizmusában, erősebb promóterek bevezetésével stb. a molekuláris nitrogént közvetlenül ammóniává redukáló nitrogenáz rendszer hatékonyságának növelése.
A fotoszintézis hatékonyságának javítása
A C4 növényeket magas növekedési és fotoszintézis sebesség jellemzi, gyakorlatilag nincs látható fotolégzésük. A C3 növényekhez tartozó legtöbb mezőgazdasági növény nagy intenzitású fotorespirációval rendelkezik. A fotoszintézis és a fotorespiráció szorosan összefüggő folyamatok, amelyek ugyanazon kulcsenzim, a ribulóz-biszfoszfát-karboxiláz (RuBPC) bifunkciós aktivitásán alapulnak. A RuBF karboxiláz nemcsak CO2-t, hanem O2-t is képes megkötni, azaz karboxilezési és oxigénezési reakciókat hajt végre. A RuBF oxigenizáció során foszfoglikolát képződik, amely a fotorespiráció fő szubsztrátjaként szolgál, a fényben történő CO2 felszabadulás folyamatában, aminek következtében néhány fotoszintetikus termék elveszik. A C4 növények alacsony fotorespirációját nem a glikolát-útvonal enzimeinek hiánya magyarázza, hanem az oxigenáz-reakció korlátozottsága, valamint a fotorespirációs CO2 reasszimilációja.
A génsebészet előtt álló egyik feladat a túlnyomó karboxiláz aktivitású RuBPC létrehozásának lehetőségének tanulmányozása.
Új tulajdonságokkal rendelkező növények beszerzése
Az elmúlt években a tudósok egy új megközelítést alkalmaztak az „antiszensz RNS-sel” (fordított vagy antiszensz RNS-sel) rendelkező transzgenikus növények előállítására, amelyek lehetővé teszik a kérdéses gén működésének szabályozását. Ebben az esetben a vektor megalkotásakor a beillesztett gén DNS-ének (cDNS) másolatát 180°-kal elfordítják. Ennek eredményeként a transzgenikus növényben egy normál mRNS-molekula és egy fordított molekula képződik, amely a normál mRNS komplementaritása miatt komplexet képez vele, és a kódolt fehérje nem szintetizálódik.
Ezt a megközelítést használták jobb gyümölcsminőségű transzgénikus paradicsomnövények előállítására. A vektor tartalmazta a PG gén cDNS-ét, amely szabályozza a poligalakturonáz, a növényi szövetek sejtközi terének fő alkotóeleme, a pektin elpusztításában szerepet játszó enzim szintézisét. A PG géntermék a paradicsom gyümölcseinek érési időszakában szintetizálódik, és mennyiségének növekedése a paradicsom puhává válásához vezet, ami jelentősen csökkenti az eltarthatóságát. Ennek a génnek a transzgénekben való letiltása lehetővé tette új gyümölcstulajdonságokkal rendelkező paradicsomnövények előállítását, amelyek nemcsak sokkal tovább tartottak, hanem maguk a növények is ellenállóbbak voltak a gombás betegségekkel szemben.
Ugyanez a megközelítés alkalmazható a paradicsom érésének szabályozására is, és ebben az esetben célpontként az EFE (etilénképző enzim) gént használják, amelynek terméke az etilén bioszintézisében részt vevő enzim. Az etilén egy gáznemű hormon, melynek egyik funkciója a gyümölcsérés folyamatának szabályozása.
Az antiszensz konstrukciók stratégiáját széles körben használják a génexpresszió módosítására. Ezt a stratégiát nemcsak új tulajdonságokkal rendelkező növények előállítására használják, hanem növénygenetikai alapkutatásokra is. Meg kell említeni a növényi géntechnológia egy másik irányát, amelyet egészen a közelmúltig főleg alapkutatásban alkalmaztak - a hormonok növényfejlődésben betöltött szerepének vizsgálatát. A kísérletek lényege az volt, hogy bizonyos bakteriális hormongének kombinációjával transzgénikus növényeket kapjanak, például csak iaaM vagy ipt stb. Ezek a kísérletek jelentősen hozzájárultak az auxinek és citokininek növényi differenciálódásban betöltött szerepének bizonyításához.
Az utóbbi években ezt a megközelítést alkalmazták a gyakorlati tenyésztésben. Kiderült, hogy a Def génpromoter (egy csak gyümölcsökben expresszálódó gén) alatti iaaM gént tartalmazó transzgenikus növények termései partenokarpikusak, vagyis beporzás nélkül képződnek. A partenokarp gyümölcsöket a magvak teljes hiánya vagy nagyon kis száma jellemzi, ami lehetővé teszi az "extra magok" problémájának megoldását, például görögdinnyében, citrusfélékben stb. Már kerültek elő olyan transzgénikus töknövények, amelyek általában nem különböznek a kontroll növényektől, de gyakorlatilag nem tartalmaznak magot.
Lefegyverzett, mentes az onkogén Ti-plazmidtól, a tudósok aktívan használják a mutációkat. Ezt a módszert T-DNS inszerciós mutagenezisnek nevezik. A növényi genomba integrálódva a T-DNS kikapcsolja azt a gént, amelybe beépült, és funkcióvesztés esetén könnyen kiválaszthatók a mutánsok (az elhallgatás jelensége - a gének elhallgatása). Ez a módszer abban is figyelemre méltó, hogy lehetővé teszi a megfelelő gén azonnali kimutatását és klónozását. Jelenleg sok új növényi mutációt nyertek ily módon, és a megfelelő géneket klónozták. Az MA Ramenskaya a T-DNS mutagenezis alapján olyan paradicsomnövényeket kapott, amelyek nem specifikusan ellenállnak a késői fertőzésnek. Nem kevésbé érdekes a munka másik aspektusa - megváltozott dekoratív tulajdonságokkal rendelkező transzgénikus növényeket kaptunk.
Ilyen például a sokszínű virágú petúnia növények termesztése. A sorban a kék rózsák következnek a kék pigment szintézisét szabályozó génnel, amelyet delphiniumból klónoztak.
genetikai módosítás ( GM) - egy élő szervezet genomjának megváltoztatása géntechnológiai technológia alkalmazásával, az egyik donor szervezettől származó egy vagy több génnek a másikba történő bejuttatásával. Egy ilyen bevezetés (transzfer) után az így létrejövő növényt már genetikailag módosítottnak vagy transzgénikusnak nevezik. A hagyományos nemesítéssel ellentétben a növény eredeti genomja szinte nem érinti, és a növény olyan új tulajdonságokat szerez, amelyekkel korábban nem rendelkezett. Ilyen jelek (jellemzők, tulajdonságok) a következők: ellenálló képesség különböző környezeti tényezőkkel (fagy, szárazság, nedvesség stb.), betegségekkel, kártevőkkel szemben, javult növekedési tulajdonságok, ellenálló képesség gyomirtókkal, növényvédő szerekkel szemben. Végül a tudósok megváltoztathatják a növények táplálkozási tulajdonságait: ízét, aromáját, kalóriatartalmát, tárolási idejét. A géntechnológia segítségével növelhető a terméshozam, ami nagyon fontos, tekintettel arra, hogy a világ népessége évről évre nő, és a fejlődő országokban növekszik az éhezők száma.
Hagyományos nemesítéssel csak ugyanazon a fajon belül lehet új fajtát nyerni. Például egy teljesen új rizsfajtát nemesíthet, ha különböző rizsfajtákat keresztez egymással. Ebben az esetben egy hibrid kombinációt kapnak, amelyből a tenyésztő csak a számára érdekes formákat választja ki.
Mivel a hibridizáció az egyes növények között zajlik, szinte lehetetlen olyan fajtát kifejleszteni, amely a számunkra érdekes tulajdonságokkal rendelkezik, amelyeket a következő generációk örökölnek. Egy ilyen probléma megoldása sok időt vesz igénybe. Ha új búzafajtát kell kifejleszteni, és ez a fajta a rizsre jellemző tulajdonságokat elsajátítani, akkor a hagyományos nemesítés itt tehetetlen. Segítségül szolgált, használatakor bizonyos jellemzőket (tulajdonságokat) át lehet vinni a kísérleti üzembe, és mindezt szinten hajtják végre DNS, egyedi gének. Hasonló módon lehet átvinni például a búzát gén fagyállóság.
A génmódosítás módszere – legalábbis elméletileg – lehetővé teszi, hogy az élő szervezetek bizonyos tulajdonságaiért felelős egyedi géneket elkülönítsék, és teljesen más organizmusokba csepegtessenek be, miközben jelentősen lerövidítik egy új faj létrehozásának idejét. Éppen ezért világszerte sok tenyésztő és tudós használja ezt a technológiát új fajták nemesítésekor. Mára peszticideknek (gyomirtóknak), kártevőknek és betegségeknek ellenálló kereskedelmi növényfajtákat fejlesztettek ki. Ezenkívül javított ízű, szárazságnak és fagynak ellenálló fajtákat is kaptak.